重組DNA技術應用

重組DNA技術應用序列檢測

病原菌感染檢測傳統(tǒng)方法：免疫反應斑點雜交與反轉(zhuǎn)斑點雜交

引物標記多重PCR擴增病原菌群引物設計：獨有的穩(wěn)定區(qū)1.診斷工具

——序列檢測第2頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1.診斷工具

——比較序列分析比較序列分析：單核苷酸多態(tài)性（SNP）

SNP：主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。是人類可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500～1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。

SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換(transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。

第3頁,共34頁，2024年2月25日，星期天基因的純合或雜合第4頁,共34頁，2024年2月25日，星期天利用SNP進行已知遺傳疾病的診斷利用SNP分析未知遺傳疾病的原因建立人類SNP庫，利用SNP芯片進行個性化診斷老年癡呆病對藥物tacrine的反應

80％無ApoE4等位基因患者，有療效

60％有ApoE4等位基因患者，惡化第5頁,共34頁，2024年2月25日，星期天×MstⅡ酶切位點(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第6頁,共34頁，2024年2月25日，星期天+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析第7頁,共34頁，2024年2月25日，星期天1.診斷工具

——限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)RFLP是根據(jù)不同個體基因組的限制性內(nèi)切酶的酶切位點堿基發(fā)生突變，或酶切位點之間發(fā)生了堿基的插入、缺失，導致酶切片段大小發(fā)生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同個體的DNA水平的差異（即多態(tài)性）NPANPA已出生的生病孩子PAPA未出生的孩子？為患病小孩的父母提供未來的產(chǎn)前診斷第8頁,共34頁，2024年2月25日，星期天由某些序列重復程度的不同引起的長度多態(tài)性變化主要與衛(wèi)星DNA序列有關可以設計多位點探針，分析DNA圖譜進行鑒定1.診斷工具——可變數(shù)目串聯(lián)重復多態(tài)性（VNTR)1985年，AlecJeffrey發(fā)現(xiàn)非編碼區(qū)的小衛(wèi)星DNA串聯(lián)重復序列可用于確定個體的特異性，他開發(fā)了一個能和多個小衛(wèi)星序列位點互補探針，檢測結果類似條形碼，被稱為DNA指紋

改進：多個單位點探針檢測（樣本量更少、有利于DNA指紋數(shù)據(jù)庫的建立、統(tǒng)計學上更為簡單）第9頁,共34頁，2024年2月25日，星期天多位點探針與單位點探針VNTR在司法上的應用第10頁,共34頁，2024年2月25日，星期天2.新藥物的生物法生產(chǎn)

一般蛋白質(zhì)產(chǎn)品必須具有絕對的真實性時（即生物加工的蛋白質(zhì)產(chǎn)品和天然提取的產(chǎn)品完全一樣），選擇哺乳動物細胞培養(yǎng)。真實性意味著不僅所有的氨基酸要有正確的排列順序，而且在培養(yǎng)細胞中的所有翻譯后修飾過程要和在完整的動物體中的翻譯后修飾過程相同。哺乳動物細胞生產(chǎn)的優(yōu)點：提供盡可能類似于天然產(chǎn)物的產(chǎn)品，真實性最好另一個優(yōu)點是大多數(shù)具有商業(yè)價值的蛋白質(zhì)都很容易被細胞分泌出來細胞培養(yǎng)生長緩慢，培養(yǎng)基昂貴，蛋白質(zhì)表達水平較低安全性問題：轉(zhuǎn)化細胞的致癌可能性、病毒轉(zhuǎn)基因動物和哺乳動物細胞培養(yǎng)2009年，F(xiàn)DA批準首個轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥物ATryn上市第11頁,共34頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)基因植物和植物細胞培養(yǎng)成本優(yōu)勢不存在內(nèi)源病毒或朊病毒的安全問題生產(chǎn)的放大很容易通過擴大種植面積來實現(xiàn)選定在植物中無菌的可食用部分生產(chǎn)蛋白質(zhì)，這樣不僅可以避免苛刻的純化過程，還可以直接將食用部分作為治療蛋白質(zhì)口服通常表達水平非常低（<總可溶性蛋白的1％）N-連接糖基化是不完全的，以及缺乏一些其它哺乳動物的翻譯后過程。需要花費大量時間來測試和生產(chǎn)足夠的種子，研制生產(chǎn)周期不能令人滿意很難對生長在地里的農(nóng)作物進行環(huán)境控制，因此隨著生產(chǎn)時間和生產(chǎn)地點的不同（即環(huán)境），產(chǎn)品的生產(chǎn)量（也可能包括質(zhì)量）變化非常大。第12頁,共34頁，2024年2月25日，星期天3.基因治療對患者細胞中的遺傳信息進行修飾來治療疾病的方法第13頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共34頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共34頁，2024年2月25日，星期天

美國醫(yī)學家W·F·安德森等人對腺苷脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個基因治療成功的范例。1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩Desilva，A進行基因治療。這個4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產(chǎn)ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經(jīng)過改造，有缺陷的基因已經(jīng)被健康的基因所替代。在以后的10個月內(nèi)她又接受了7次這樣的治療，同時也接受酶治療。經(jīng)治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

Desilva，A

，1999第16頁,共34頁，2024年2月25日，星期天4.重組疫苗失活毒株或活體減毒毒株（有一定危險性）重組亞單位疫苗（保真度差、無法有效刺激免疫反應）重組細菌疫苗（接種細菌）

以減毒細菌為宿主表達異源抗原，能夠有效刺激免疫反應重組病毒疫苗（接種病毒）

以病毒為載體表達異源抗原，或破壞毒素基因植物可食用疫苗（通過轉(zhuǎn)基因植物表達病毒或病菌抗原）DNA疫苗（在宿主中引入編碼抗原的DNA分子）第17頁,共34頁，2024年2月25日，星期天鑒定毒性基因的技術啟動子誘捕庫體內(nèi)展示技術（IVET）差異熒光誘導技術第18頁,共34頁，2024年2月25日，星期天5.蛋白質(zhì)工程通過各種方法使蛋白質(zhì)分子的結構發(fā)生某些改變，從而改變蛋白質(zhì)的某些特性和功能的技術過程稱為蛋白質(zhì)工程提高活力activity增強穩(wěn)定性stability降低或消除抗原性immunologicalproperty研究和了解分子中主鏈、側鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構象的影響第19頁,共34頁，2024年2月25日，星期天氨基酸或核苷酸的置換修飾可以采用化學修飾方法，例如，Bender等成功地利用化學修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學修飾法難度大，成本高，專一性差，而且要對酶分子逐個進行修飾，操作復雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

現(xiàn)在常用的氨基酸置換修飾的方法是定點突變技術。定點突變（sitedirectedmutagenesis）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種基因操作技術。是指在DNA序列中的某一特定位點上進行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術。是蛋白質(zhì)工程（ProteinEngineering）和酶分子組成單位置換修飾中常用的技術。定點突變技術，為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進、可靠、行之有效的手段。氨基酸置換修飾第20頁,共34頁，2024年2月25日，星期天酶分子的定點突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結構分析3、酶活性中心分析4、引物設計進行基因定點突變5、酶基因克隆表達6、變異特性分析第21頁,共34頁，2024年2月25日，星期天酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來說，熱穩(wěn)定性有較大的提高?？乖裕罕容^公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類失活因子的抵抗力：修飾酶對蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強對熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。第22頁,共34頁，2024年2月25日，星期天定向進化蛋白質(zhì)的合理設計(rationaldesign)

氨基酸序列比對、蛋白質(zhì)三維構象、殘基功能分析

蛋白質(zhì)的定向進化(directedevolution)第23頁,共34頁，2024年2月25日，星期天體外定向進化的意義理論上，蛋白質(zhì)分子蘊藏著很大的進化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是體外定向進化的基本先決條件。所謂酶的體外定向進化，又稱實驗分子進化，屬于蛋白質(zhì)的非合理設計，它不需事先了解酶的空間結構和催化機制，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進化機制(隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶。酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領域逐漸顯示其生命力。第24頁,共34頁，2024年2月25日，星期天定向進化的原理第25頁,共34頁，2024年2月25日，星期天DNAShufflingStemmer在1994年首先提出的一種體外分子定向進化方法同傳統(tǒng)的分子進化方法相比，DNAShuffling可以更快地加速分子進化的進程、取得更好的進化效果通過定向進化方法改進酶的特性、甚至創(chuàng)造出新酶成為對代謝途徑進行改造的一種非常有用的策略。第26頁,共34頁，2024年2月25日，星期天提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量

實例:Arnold等人通過定向進化改變了乙內(nèi)酰脲酶對底物的對映體選擇性（從D型變?yōu)長型），并使酶活力提高了5倍，這種進化后的酶和另外三種Met合成途徑中的酶一起表達后大幅度提高了L-Met的合成速度。提高酶蛋白在各種極端物理或化學環(huán)境下的活力和穩(wěn)定性，對不同來源的蛋白質(zhì)的優(yōu)良性狀進行組合

實例:Ness等人通過對26種枯草桿菌蛋白酶基因的Shuffling

而在酶活力、熱穩(wěn)定性、溶劑穩(wěn)定性等方面的特性取得了較大的進展實例:兩種

-glycosidase基因的DNAShuffling定向進化的應用

—優(yōu)化代謝途徑第27頁,共34頁，2024年2月25日，星期天extremestabilityglucoseinhibitionlactosehydrolysislowerstabilitynoinhibitionlactosehydrolysisCelBPyrococcus(100oC)LacSSulfolobus(85oC)Geneshufflingoftwob-glycosidasesCelB-LacShybridSB20approachesCelBstabilitylesssubstrateinhibitionhighlactosehydrolysisGeneshuffling★★★★★★第28頁,共34頁，2024年2月25日，星期天Hybrids-improvedhydrolysisoflactoseandcellobiose乳糖

纖維二糖Geneshufflingoftwob-glycosidases第29頁,共34頁，2024年2月25日，星期天6.代謝工程代謝工程定義：利用DNA重組技術對特定的生化反應進行修飾或引入新的反應以定向改進產(chǎn)物的生成或細胞的性質(zhì)。上述定義的基本特征是：通過分析確定要修飾的目標反應、或打算要新引入的特定生化反應。一旦目標被確定，那么就要應用已建立的分子生物學技術對相應的基因或酶進行擴增、抑制或缺失、或解除調(diào)控。為了達到上述目的，需要應用DNA重組技術。第30頁,共34頁，2024年2月25日，星期天定向改進：合理設計？如何對酶活進行設計，著重于“量”

隨機誘變與定向篩選技術：

有利基因突變信息、有利突變的組合信息、途徑結構與控制方面重要信息，著重于“質(zhì)”

反向代謝工程（有利突變點在野生菌株中的重新組裝）分子進化工程

基因或酶的人工定向進化:DNAShuffling

基因或酶分子的合理設計：計算機上的模擬

第31頁,共34頁，2024年2月2