RPA檢測方法研究進展

重組酶聚合酶擴增技術(shù)（Recombinasepolymeraseamplification,RPA）是近年來興起的一種等溫核酸擴增技術(shù)。RPA引物探針設(shè)計要求簡單，能在37℃~42℃的溫度實現(xiàn)擴增，利用重組酶與引物結(jié)合并尋找與引物互補的同源序列，解鎖局部雙鏈DNA，不需要對模板高溫變性，20~30分鐘可獲得大量擴增產(chǎn)物。反應(yīng)時間長短取決于起始模板拷貝數(shù)和擴增子大小。RPA一般耐受有3~5個錯配的堿基，即不影響RPA反應(yīng)性能。此外，該技術(shù)比其他DNA擴增方法具有降低基質(zhì)相關(guān)抑制劑影響的潛力。與傳統(tǒng)方法相比，該方法具有反應(yīng)溫度低、反應(yīng)時間短、不需要昂貴設(shè)備等優(yōu)點，試劑是凍干粉形式，不需要冷鏈儲存，操作更簡單，結(jié)果可通過凝膠電泳或?qū)崟r監(jiān)測熒光信號進行分析?？偟膩碚f，RPA檢測方法有利于廣泛開發(fā)用于現(xiàn)場及實驗室病原微生物的檢測。一

RPA檢測方法概述RPA是當(dāng)下發(fā)展較快的恒溫擴增技術(shù)之一，可以在恒定溫度（37~42℃）下實現(xiàn)指數(shù)擴增，無需對DNA樣品進行熱預(yù)處理，其擺脫了精密溫度循環(huán)系統(tǒng)，更加有利于基層的推廣和應(yīng)用。2014年以來，英國TwistDx公司開發(fā)RPA檢測試劑盒加快了RPA技術(shù)的迅猛發(fā)展。目前英國TwistDx公司開發(fā)的RPA商品化試劑盒主要有六種，即TwistAmpBasic、TwistAmpBasicRT、TwistAmpexo、TwistAmpexoRT、TwistAmpfpg、TwistAmpnfo。Basic是RPA試劑盒的基礎(chǔ)款，包含擴增反應(yīng)所需的所有酶和試劑，實驗需要準(zhǔn)備引物和模板，結(jié)果通過瓊脂糖核酸凝膠電泳方法讀??；BasicRT除包含Basic試劑盒中的成份外，還包含逆轉(zhuǎn)錄酶，適用于以RNA為模板的核酸擴增，實驗需要額外準(zhǔn)備RNA酶抑制劑；exo屬于實時熒光型，需要設(shè)計exo探針，包括熒光基團（CarboxyFluorescein,FAM）、猝滅基團（BlackHoleQuencher,BHQ）及兩個基團之間的四氫呋喃（Tetrahydrofuran,THF），3’末端標(biāo)記一個修飾基團C3-spacer，實驗中添加核酸外切酶對THF進行切割，分離FAM和BHQ后產(chǎn)生熒光。所以exo方法只適合實時熒光的檢測；exoRT和exo區(qū)別在于以RNA為模板的熒光核酸擴增；fpg也屬于實時熒光型，fpg酶切割的是dR基團，保證fpg探針和擴增子依然完好，因此該方法結(jié)果可以通過熒光機器和凝膠電泳分析；nfo結(jié)果通過測流層析試紙條分析。這些試劑盒適用以DNA或RNA的擴增反應(yīng)，結(jié)果可以通過核酸電泳、熒光和試紙條多種形式呈現(xiàn)。二

RPA檢測方法原理RPA技術(shù)主要酶試劑包括：重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbinding,SSB）和鏈替換DNA聚合酶，酶活性對溫度要求不高，最佳條件范圍為37℃~42℃。重組酶作用是催化引物與同源序列結(jié)合，如T4噬菌體UvsX蛋白、RecA及其他經(jīng)過工程菌改造和修飾的重組酶。重組酶與引物雜交形成核蛋白復(fù)合體后，開始搜索模板雙鏈DNA中的同源區(qū)域，一旦同源序列被定位就會形成D-loop型結(jié)構(gòu)。SSB主要來自T4噬菌體的gp32蛋白或其衍生物。當(dāng)核蛋白復(fù)合體和模板DNA中的同源鏈形成D-loop型結(jié)構(gòu)后，單鏈DNA另一側(cè)結(jié)合SSB保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，防止引物的脫落。聚合酶主要來自枯草芽抱桿菌Bsu蛋白、Bst蛋白等。引物與模板鏈雜交后，重組酶從核蛋白復(fù)合體上脫離，在D-loop型一側(cè)引發(fā)鏈置換反應(yīng)，聚合酶Bsu隨即結(jié)合在引物的3’端進行核酸分子指數(shù)擴增。除此之外，重組酶裝載因子（主要來自T4噬菌體的uvsY蛋白）以及擁擠試劑（crowdingagentCarbowax20/聚乙二醇PEG）在構(gòu)建最優(yōu)的RPA反應(yīng)環(huán)境也起到重要作用。二者可以改變反應(yīng)動態(tài)平衡，使其朝著有利重組酶裝載的方向發(fā)展。三

RPA技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀目前，RPA技術(shù)在病原檢測方面研究較多，已經(jīng)建立了針對細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種病原體診斷方法。此外，RPA技術(shù)在食品安全方面可以用于檢測轉(zhuǎn)基因成分以及可以用于癌細(xì)胞檢測、基因突變等多方面。檢測樣品類型也多種多樣，涉及到動、植物樣品等各個類型，在諸多方面取得一定的成果，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。1.RPA技術(shù)在病毒檢測方面的應(yīng)用在動物病毒檢測方面，已經(jīng)建立起了多種RPA檢測方法。豬病病毒如非洲豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬藍耳病病毒；反芻動物病病毒如口蹄疫病毒、羊口瘡病毒、牛冠狀病毒；禽病病毒如H5N1、H7/N9等不同亞型；水生動物病毒如白斑綜合癥病毒、傳染性皮下和造血器官壞死病毒、錦鯉皰疹病毒。這些檢測方法在30分鐘內(nèi)就能完成，檢測限在10~1000個拷貝之間。植物病毒如通過RPA方法檢測黃葉卷曲病毒等。對于人類病毒性疾病的RPA檢測方法，如RPA可以在20分鐘內(nèi)檢測到低拷貝量的HIV-1RNA，適合非洲地區(qū)戶外檢測使用；Faye等建立了埃博拉病毒RT-RPA方法，可以短時間檢測到低至15拷貝的核酸分子。2.RPA技術(shù)在細(xì)菌性病原檢測方面的應(yīng)用相對于病毒檢測，細(xì)菌檢測大多數(shù)是通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定，這種方法不僅耗時耗力，而且操作過程中可能會對實驗人員安全產(chǎn)生一定的威脅。因此，建立快捷準(zhǔn)確的分子檢測技術(shù)對于細(xì)菌病原鑒定有現(xiàn)實意義。細(xì)菌RPA技術(shù)檢測最早應(yīng)用于耐藥性金黃色葡萄球菌的研究。之后采用exo-RPA、LF-RPA等多種技術(shù)，檢測布魯氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、阪崎克羅諾桿菌、空腸彎曲桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等，檢測靈敏度好，特異性強，反應(yīng)時間短，比較適合資源有限的現(xiàn)場檢測，具有良好的應(yīng)用前景。3.RPA技術(shù)在檢測寄生蟲方面的應(yīng)用寄生蟲病嚴(yán)重危害畜禽養(yǎng)殖業(yè)，通常對其早期診斷主要依靠臨床表現(xiàn)或者從動物分泌物等分離觀察卵或者幼蟲。RPA技術(shù)作為快速準(zhǔn)確的現(xiàn)場檢測方法，在早期寄生蟲檢測方面具有很大的優(yōu)勢。已有關(guān)于研究賈第鞭毛蟲、阿米巴蟲、惡性虐原蟲等的RPA檢測方法的報道。除了上述三大主要類別的檢測，還有關(guān)于動物支原體的檢測如山羊支原體、豬肺炎支原體、綿羊肺炎支原體等通過exo-RPA以及LF-RPA技術(shù)，為支原體感染的診斷提供便捷的方法。常見病原經(jīng)常性會混合感染，所以RPA檢測技術(shù)不會局限于單一的病原檢測，有望向著多重檢測方向發(fā)展，擴大檢測的范圍。如分別建立了關(guān)于不同細(xì)菌和病毒的多重RPA檢測技術(shù)。此外，檢測結(jié)果形式也不局限于熒光檢測或者試紙條檢測，已有將RPA技術(shù)和固相芯片技術(shù)、微流體數(shù)字化、電化學(xué)等其他技術(shù)相結(jié)合。在不同領(lǐng)域中朝著高通量以及快速檢測的方向發(fā)展。如利用RPA和ELISA結(jié)合，探針在微孔板上反應(yīng)之后用比色法檢測花生、玉米、大豆等作物的過敏原和轉(zhuǎn)基因；結(jié)合RPA和ISAD檢測癌癥單堿基突變。微流體技術(shù)是將樣品準(zhǔn)備和分子擴增檢測結(jié)為一體的技術(shù)，簡化了試劑準(zhǔn)備過程，利于RPA大規(guī)模使用。如結(jié)合RPA和微流體芯片進行全自動分析；將微陣列技術(shù)和多重RPA結(jié)合；結(jié)合RPA和微流體滑動芯片。RPA-微流體技術(shù)集成度較高，但是程序復(fù)雜、成本較高。目前進行現(xiàn)場推廣可行性不大，但是該技術(shù)是實驗全自動化的一個重要方式，解決現(xiàn)有問題之后，該技術(shù)更適用于非專業(yè)人員操作以及資源短缺的情況。這些研究都是為了增加該技術(shù)實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測的可能性。四

總結(jié)和未來展望與其他等溫擴增技術(shù)相比，RPA優(yōu)點是可以在溫度范圍37~42℃條件下工作，不需要嚴(yán)格控制內(nèi)部溫度，這是一個不同于其他等溫技術(shù)的重要特點。RPA還具有便捷、高靈敏性和特異性、擴增效率高、實驗設(shè)計簡單等優(yōu)點。即使存在一些已知的PCR抑制劑或粗提物，RPA也能在20分鐘的時間內(nèi)擴增出低至1~10個目標(biāo)拷貝，而且可以擴增不同種類生物的RNA和DNA靶標(biāo)。此外，RPA試劑以凍干的形式保存，室溫保存至少為6個月，而其他的等溫技術(shù)試劑都需要冷藏，現(xiàn)場應(yīng)用受限。RPA檢測技術(shù)在分子診斷、食品質(zhì)量控制、環(huán)境分析等方面具有廣闊的發(fā)展和應(yīng)用空間。目前還沒有針對RPA特