基因工程工具酶

基因工程常用工具酶限制性內(nèi)切酶DNA連接酶DNA聚合酶修飾酶1基因工程工具酶5/8/2024限制性內(nèi)切酶1、發(fā)現(xiàn)歷史2、分類和命名3、Ⅱ型核酸內(nèi)切酶基本特征4、酶切反應(yīng)要點(diǎn)5、雙酶切的技巧2基因工程工具酶5/8/2024核酸酶的分類

內(nèi)切酶

──非專一性──外切酶

核酸酶─內(nèi)切酶

──RNA─

外切酶

———專一性─非限制性──內(nèi)切酶─

限制性──DNA───外切酶

3基因工程工具酶5/8/2024限制性內(nèi)切酶的類型基因工程中最常用的是Ⅱ型酶4基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型酶的命名、書寫規(guī)則1、前三個(gè)字母用斜體，其他用正體表示。2、前三個(gè)字母來自于產(chǎn)生該酶的微生物的拉丁名，其中，第1個(gè)為屬名的第一個(gè)字母，后兩個(gè)為種名的前兩個(gè)字母。3、如果酶存在于一種特殊菌株中，三個(gè)字母后加上菌株名稱符號(hào)；4、名稱最后部分往往包含羅馬數(shù)字,表示在該特殊菌株中發(fā)現(xiàn)這種酶的先后次序。（示例）5基因工程工具酶5/8/2024

限制酶來源剪切方式EcoRIEscherichiacoliRY13G↓AATTCPstI Providenciastuartii164

CTGCA↓G6基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型核酸內(nèi)切酶基本特征1、每一種酶都有各自特異的識(shí)別序列。

(1)

序列不同

(2)長(zhǎng)度不同：4－7bp(3)但與DNA來源無關(guān)2、識(shí)別序列一般具有回文結(jié)構(gòu)。

5’

G↓AATTC3’3’CTTAA↑G5’3.切割后,產(chǎn)物的特點(diǎn)

（1）5’－pi,3’—OH

（2）平端粘端－－都是5’

突出或都是3’

突出（3）粘端可重新通過氫鍵配對(duì)4.特殊性質(zhì)

7基因工程工具酶5/8/2024EcoR1切割8基因工程工具酶5/8/2024Ⅱ型核酸內(nèi)切酶的特殊性質(zhì)1、同位酶：

識(shí)別相同序列，但切割位點(diǎn)不一樣的酶(如SmaI和XmaI)2、同尾酶:

識(shí)別位點(diǎn)不同，但切割出相同的末端序列（BamHI和BclI)；3、同裂酶：

識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)都相同的酶（HpaI和HincⅡ)；4、甲基化的調(diào)節(jié)：

MspI(所有）和HpaⅡ(非甲基化）5、Star活性（星號(hào)活性）：在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下,也能切割一些與其特異識(shí)別序列類似的序列。在酶的名稱右上角加一個(gè)星號(hào)(*)表示,如EcoRⅠ*。6、位置效應(yīng)

酶對(duì)同一個(gè)DNA底物上的不同酶切位點(diǎn)的切割速率不同（側(cè)翼序列太短無法切）9基因工程工具酶5/8/2024酶切反應(yīng)要點(diǎn)1.溫度:一般37°C,特殊25°C(SmaI)2.對(duì)Na+要求不一樣分成3類:【低鹽（0)】【中鹽（50mM】【高鹽（100mM)】3、盡量使反應(yīng)體積最小,但酶的用量不超過總體積的10%(甘油抑制酶活)4.決不能用水稀釋,以免變性失活。5.先配好其它試劑，最后才加酶；6.取酶立即放于冰上，用完后立即放入－20°C。7.使用無菌的新槍頭。10基因工程工具酶5/8/2024雙酶切的技巧

1、兩種酶buf不一樣

(1)選通用buf(2)先用(低鹽buf+E低)反應(yīng),后補(bǔ)高鹽buf+E高反應(yīng)；

2.兩種酶反應(yīng)溫度不一樣：（1）先(E1+T1)反應(yīng),后（E2＋T2）反應(yīng)；

3.E1結(jié)果影響E2反應(yīng)：

(1)先加E2反應(yīng),后加E1反應(yīng)11基因工程工具酶5/8/2024連接酶(DNAligase)1.作用原理2用途3.操作要點(diǎn)12基因工程工具酶5/8/2024連接酶的作用原理在E.coli和動(dòng)植物細(xì)胞中都有此酶。能催化DNA

中相鄰的3`-OH和5`-P之間形成磷酸二脂鍵。13基因工程工具酶5/8/202414基因工程工具酶5/8/2024FunctionofT4DNAligase(1)能封閉DNA雙鏈或RNA/DNA雜種雙鏈中的單鏈缺口，而不能封閉雙鏈RNA中的單鏈缺口(2)能封閉粘性末端退火后出現(xiàn)的缺口；用途：(1)通過粘端連接DNA分子；(2)連接平端雙鏈DNA分子或平端DNA與人工接頭的連接。15基因工程工具酶5/8/2024連接酶操作要點(diǎn)T：多數(shù)內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端的Tm值在15℃以下,然而保持連接酶活性的最適溫度卻是37℃,因此最適溫度是粘性末端的Tm值和連接酶最適溫度的折衷。經(jīng)常采用16℃（4-16℃）。DNAconcentrations：外源片段濃度比載體DNA濃度高10-20倍防止環(huán)化：堿性磷酸酶預(yù)先處理質(zhì)粒載體Time:O/Nbetter平端連接:加大酶量16基因工程工具酶5/8/2024DNA聚合酶Taq酶Klenow酶反轉(zhuǎn)錄酶末端轉(zhuǎn)移酶17基因工程工具酶5/8/2024Taq酶耐熱DNA聚合酶:94℃能較長(zhǎng)時(shí)間保持活性,最適溫度72℃;方向:5’3’底物:模板+引物+dNTP(還需Mg2+)反應(yīng)速度:1kb/min不同種類的Taq酶功能不同.用途:(1)PCR(2)sequence(3)TAclone18基因工程工具酶5/8/2024Klenow酶特點(diǎn):DNA聚合酶Ⅰ的C-端大片段(被枯草桿菌蛋白酶切割)MW＝76kD5`→3`聚合酶活性(合成)4.3`→5`外切酶活性(矯正)用途:DNA探針的標(biāo)記2.平端化:補(bǔ)平3’凹端或切除3’凸端19基因工程工具酶5/8/2024反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)兩種:

AMV(來源于鳥類腫瘤病毒)--------42℃反應(yīng)

M.MLV(來源于鼠白血病毒)-------37℃反應(yīng)主要特點(diǎn):(1)RNADNA（√）

(2)DNADNA(3)外切RNA(4)不具有糾錯(cuò)功能用途：

(1)mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA(2)以ssDNA或RNA為模板合成雜交探針

20基因工程工具酶5/8/2024末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)1.取自小牛胸腺2.催化脫氧核苷酸與DNA的3`-OH結(jié)合引物或底物是帶有3`-OH基的ssDNA或帶有突出的雙鏈DNA。不要求模板。3.兩種反應(yīng)：

Mn2+

或Mg2+ssDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppiCo2+dsDNAOH+ndNTPDNA-(pdN)n+nppi4、用途：加一個(gè)同源多聚物，便于未知序列的操作。21基因工程工具酶5/8/2024修飾酶1、T4多核苷酸激酶2、堿性磷酸化酶3、核酸酶

(1)核酸酶Bal31(2)核酸外切酶Ⅲ(3)單鏈核酸酶S14、DNA甲基化化酶

22基因工程工具酶5/8/2024T4多核苷酸激酶(Kinase)

作用原理：催化ATP的γ－Pi轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5’-OH,使之磷酸化。用途：放射性標(biāo)記DNA鏈的5‘末端，探針標(biāo)記注意：（1）銨離子是該酶的強(qiáng)烈抑制劑,處理前,DNA不能溶解于含銨鹽的緩沖液中。（2）低濃度的磷酸也可抑制該酶活性。（3）該酶很難純化,酶制品經(jīng)常不純。23基因工程工具酶5/8/2024堿性磷酸化酶作用原理：切除DNA、RNA、rNTP和dNTP上的5‘磷酸基團(tuán),變成5’OH。來源：（1）細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)：BAP活性更高,對(duì)熱和去污劑抗性更強(qiáng),因此脫磷酸化后很難完全抑制BAP活性。（2）牛小腸堿性磷酸酶(CIP)：除去CIP可用蛋白酶K降解用途：（1）從DNA片段上除去5‘磷酸以防自身連接。（2）在放射性標(biāo)記DNA5‘末端前，除去磷酸。

24基因工程工具酶5/8/2024核酸酶Bal31具兩種活性：(1)雙鏈特異外切酶活性；從dsDNA的3`和5`切除寡核苷酸或單核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸)可終止反應(yīng)(2)單鏈特異內(nèi)切酶活性：專門從單鏈DNA切除帶有5`末端的單鏈核苷酸和寡核苷酸(類似于核酸酶S1的單鏈特異性核酸內(nèi)切酶活性)

Ca2+Ca2+

25基因工程工具酶5/8/2024

Ca2+

用途：1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子變小，在T4連接酶的作用下連接接頭和載體。2.繪制DNA的限制圖譜。

Bal31與限制性內(nèi)切酶協(xié)同作用可繪制物理圖譜.還可逐步縮短DNA片斷，使之適合構(gòu)建嵌合質(zhì)粒。Bal31de內(nèi)切酶活性已用于檢測(cè)致癌劑與突變劑引起的DNA雙鏈損傷2