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水產(chǎn)品中河豚毒素的快速檢測(cè)膠體金免疫層析法本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中河豚毒素的膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。本文件適用于河豚魚、織紋螺、蝦等水產(chǎn)品中的河豚毒素成分的快速篩查。2規(guī)范性引用文件所有的修改單)適用于本文件。GB5009.206—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)水產(chǎn)品中河豚毒素的測(cè)定》GB/T6682實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義3.1檢測(cè)線testline3.2質(zhì)控線controlline即C線,用于驗(yàn)證試劑的有效性。4原理本方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析原理。樣品中河豚毒素經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的河豚毒素特異性抗體結(jié)合,抑制抗體和檢測(cè)卡中檢測(cè)線(T線)上河豚毒素抗原檢測(cè)線顏色深淺的變化。通過檢測(cè)線與質(zhì)控5試劑與材料除非另有說明,本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。5.1試劑5.1.1乙酸(CH3COOH)。5.1.2對(duì)甲苯磺酸(TsOH)。5.2試劑配制2混合均勻。):),溶于800mL水中,最后加水定容至1000mL。5.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)表1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息英文名稱CAS登錄號(hào)分子式相對(duì)分子質(zhì)量河豚毒素Tetrodotoxin4368-28-9C11H17O8N3注:經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制):乙酸-水溶液(5.2.2)溶解,轉(zhuǎn)移至10mL5.4.2河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)中間液(50μg/mL):移取河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(5.3.1)500μL置于10mL容量瓶中,用磷酸鹽緩沖液(5.2.3)稀釋至刻度,搖勻,配制成濃度為50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。?20℃避光保存,有效期3個(gè)月。mL容量瓶中,用磷酸鹽緩沖液(5.2.3)稀釋至刻度,搖勻工作液。?20℃避光保存,有效期3個(gè)月。注:為避免毒素的危害,應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。移液器吸頭等用過的器材、廢棄的提取液等應(yīng)在氫氧化鈉溶液(1mol/L)中浸泡1h以上,以使毒素分解。5.5空白試樣經(jīng)參比方法(GB5009.206—2016)檢測(cè)不含河豚毒素的水產(chǎn)品。5.6材料河豚毒素膠體金免疫層析試劑盒:一般包含膠體金試紙條、金標(biāo)微孔及儲(chǔ)存條件:室溫、密封、避光、通風(fēng)干燥保存,保質(zhì)期12個(gè)月。6儀器與設(shè)備6.1天平:感量為0.1mg和0.01g。6.6離心機(jī):轉(zhuǎn)速≥4000r/min。6.7膠體金讀數(shù)儀(可選)7分析步驟7.1試樣制備河豚去皮去內(nèi)臟,將肌肉部分用水清洗魚體表面的污物,濾紙吸干魚體表面的水分后用剪刀將魚體分解成肌肉、肝臟、皮膚和性腺(精巢或卵巢)等部分,各部分組織分別用水洗去并標(biāo)明標(biāo)記。7.2試樣提取充分渦旋振蕩,4000r/min離心2min。取200μL上清液于5mL離心管中,加入400μL磷酸鹽緩沖液(5.2.3),渦旋混合30s,作為待測(cè)液。7.3試樣測(cè)定取100μL樣品待測(cè)液加入金標(biāo)微孔中,充分混勻后室溫孵育3min,隨后將微孔內(nèi)的所有溶液吸出,加到試紙條的樣品墊上,反應(yīng)5min后觀察結(jié)果。7.4質(zhì)量控制7.4.1每批樣品應(yīng)同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)和質(zhì)控試驗(yàn)。7.4.1.1空白試驗(yàn)7.4.1.2質(zhì)控試驗(yàn)使河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為10μg/kg,按照7.1、7.2和7.3步驟與試樣同法操作。7.4.2空白試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陰性,加標(biāo)質(zhì)控試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。8性能指標(biāo)8.1性能指標(biāo)計(jì)算方法按照附錄A執(zhí)行。8.2檢出限:10μg/kg8.3靈敏度:≥99%。8.4假陰性率:≤1%。8.5假陽(yáng)性率:≤3%。8.6特異性;≥97%。9結(jié)果判定通過對(duì)比C線和T線的顏色深淺進(jìn)行結(jié)果判定,目視判定示意圖見圖1或2。結(jié)果判定也可根據(jù)產(chǎn)品說明書進(jìn)行。9.1無(wú)效:C線不顯色,表明不正確操作或試紙條/檢測(cè)卡無(wú)效。品中不含待測(cè)組分或含量低于方法檢測(cè)限,判為陰性。9.3陽(yáng)性結(jié)果:C線線顯色,T線顏色比C線顏色明顯淺或T線不顯色,均表示樣品中待測(cè)組分含量高于方法檢測(cè)限,判為陽(yáng)性。注:T線為檢測(cè)線,C線為質(zhì)控線。圖1試紙條目視判定示意圖注:T線為檢測(cè)線,C線為質(zhì)控線。圖2檢測(cè)卡目視判定示意圖的測(cè)定》中第三法液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行確證。5方法規(guī)定的各項(xiàng)性能指標(biāo)??焖贆z測(cè)方法性能指標(biāo)計(jì)算表快速檢測(cè)方法性
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