《施馬倫貝格病診斷技術(shù)gbt+43159-2023》詳細(xì)解讀

《施馬倫貝格病診斷技術(shù)gb/t43159-2023》詳細(xì)解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4縮略語5生物安全措施6臨床診斷7樣品采集與處理contents目錄8實驗室診斷9綜合判定附錄A(規(guī)范性)病毒分離及血清中和試驗相關(guān)溶液的配制附錄B(資料性)熒光RT-PCR引物和探針序列信息附錄C(規(guī)范性)DEPC處理水的配制附錄D(規(guī)范性)阻斷ELISA抗體檢測相關(guān)溶液的配制contents目錄附錄E(資料性)血清中和試驗(噬斑減少中和試驗)測定示例參考文獻(xiàn)011范圍0102涵蓋的病毒種類與SBV密切相關(guān)的其他蟲媒病毒，如近似施馬倫貝格病毒。施馬倫貝格病毒（Schmallenbergvirus，簡稱SBV）的各個亞型。適用的樣本類型動物的血液、組織、分泌物和排泄物等樣本。環(huán)境中的水源、土壤、昆蟲等可能攜帶病毒的樣本。123包括病毒分離、鑒定和純化等技術(shù)。病原學(xué)檢測如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、間接免疫熒光試驗（IFA）等。血清學(xué)檢測如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實時熒光定量PCR等。分子生物學(xué)檢測適用的檢測方法和技術(shù)0102標(biāo)準(zhǔn)的適用領(lǐng)域和對象為動物養(yǎng)殖、屠宰、加工、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)的施馬倫貝格病監(jiān)測和防控提供技術(shù)支撐。適用于動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)、動物診療機(jī)構(gòu)、科研院校等。022規(guī)范性引用文件03遵循我國相關(guān)的法律法規(guī)和診斷技術(shù)規(guī)范，確保診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。01本標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)國內(nèi)外施馬倫貝格病相關(guān)的診斷技術(shù)、病原學(xué)、流行病學(xué)等研究資料制定。02參照了世界動物衛(wèi)生組織（WOAH）對施馬倫貝格病的診斷、報告和監(jiān)測要求。診斷技術(shù)依據(jù)相關(guān)術(shù)語定義詳細(xì)闡述了施馬倫貝格病、病原學(xué)、流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等相關(guān)術(shù)語及其定義。對診斷過程中涉及的樣品采集、保存、運(yùn)輸?shù)刃g(shù)語進(jìn)行規(guī)范，確保各方溝通順暢，減少誤解。介紹了施馬倫貝格病的病原學(xué)診斷方法，包括病毒分離鑒定、分子生物學(xué)檢測等。闡述了血清學(xué)診斷方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、病毒中和試驗（VNT）等。簡述了臨床診斷及流行病學(xué)調(diào)查在施馬倫貝格病診斷中的應(yīng)用。診斷方法概述03介紹了樣品處理的方法和步驟，包括樣品的預(yù)處理、提取、純化等，為后續(xù)檢測工作奠定基礎(chǔ)。01明確了樣品采集的種類、時間、部位及數(shù)量等要求，確保樣品的有效性和代表性。02規(guī)定了樣品的保存條件、運(yùn)輸方式及注意事項，防止樣品在采集、保存和運(yùn)輸過程中發(fā)生變質(zhì)或損壞。樣品采集與處理033術(shù)語和定義施馬倫貝格病是一種由施馬倫貝格病毒引起的、主要影響反芻動物的急性或慢性非化膿性腦炎。該病以發(fā)熱、沉郁、共濟(jì)失調(diào)、抽搐、癱瘓和死亡為特征，對畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。定義臨床表現(xiàn)施馬倫貝格病病毒分類施馬倫貝格病病毒屬于布尼亞病毒科、正布尼亞病毒屬的成員。病毒特性病毒具有包膜，其基因組為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。病毒主要通過節(jié)肢動物進(jìn)行傳播。施馬倫貝格病病毒診斷技術(shù)診斷方法包括病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷等方法。應(yīng)用各種診斷方法適用于不同感染階段和樣本類型，為準(zhǔn)確判定施馬倫貝格病提供有力支持。樣品類型包括血液、組織、腦脊液等。采集要求樣品采集需遵循無菌操作原則，避免交叉污染，同時確保樣品具有代表性。處理方法樣品經(jīng)過適當(dāng)處理后可提取病毒RNA或進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，為后續(xù)檢測提供基礎(chǔ)。樣品采集與處理044縮略語

施馬倫貝格病相關(guān)縮略語SBV施馬倫貝格病毒（SchmallenbergVirus）的縮寫，代表引發(fā)施馬倫貝格病的病原體。RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）的縮寫，用于檢測病毒核酸的一種高靈敏度技術(shù)。ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay）的縮寫，用于檢測病毒抗體或抗原的免疫學(xué)方法。DNA01脫氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）的縮寫，是病毒的遺傳物質(zhì)。RNA02核糖核酸（RibonucleicAcid）的縮寫，某些病毒（如施馬倫貝格病毒）以RNA作為遺傳物質(zhì)。PCR03聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction）的縮寫，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于擴(kuò)增特定的DNA片段。診斷技術(shù)相關(guān)縮略語標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)縮略語GB國家標(biāo)準(zhǔn)的縮寫，代表中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)的制定和發(fā)布機(jī)構(gòu)。T推薦性標(biāo)準(zhǔn)的縮寫，與強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)相對，代表標(biāo)準(zhǔn)實施的非強(qiáng)制性。WHO世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization）的縮寫，是聯(lián)合國系統(tǒng)內(nèi)負(fù)責(zé)公共衛(wèi)生的權(quán)威機(jī)構(gòu)。OIE世界動物衛(wèi)生組織（WorldOrganisationforAnimalHealth）的縮寫，是負(fù)責(zé)動物健康與福利的國際組織。其他常用縮略語055生物安全措施針對施馬倫貝格病的特點，構(gòu)建完善的疫情監(jiān)測體系，確保及時發(fā)現(xiàn)疫情。建立健全疫情監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)對重點地區(qū)、重點場所進(jìn)行定期疫情調(diào)查，掌握疫情動態(tài)。定期開展疫情調(diào)查發(fā)現(xiàn)疫情后，應(yīng)按照規(guī)定的程序和時間及時上報，以便迅速采取應(yīng)對措施。疫情報告制度5.1疫情監(jiān)測與報告對引進(jìn)的動物進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫，防止施馬倫貝格病病原體的傳入。嚴(yán)格實施檢疫措施在疫情發(fā)生時，對疫點、疫區(qū)進(jìn)行隔離封鎖，防止疫情擴(kuò)散。疫情發(fā)生時的隔離措施5.2檢疫與隔離對動物飼養(yǎng)場所、屠宰加工場所等進(jìn)行定期消毒，殺滅環(huán)境中的病原體。定期開展消毒工作對病死動物及其污染物進(jìn)行無害化處理，防止病原體的傳播和擴(kuò)散。無害化處理病死動物及污染物5.3消毒與無害化處理5.4免疫預(yù)防與藥物防治根據(jù)疫情形勢和動物免疫情況，制定合理的免疫程序，提高動物抵抗力。免疫預(yù)防策略在疫情發(fā)生時，結(jié)合臨床癥狀和實驗室診斷結(jié)果，選用有效的藥物進(jìn)行治療，降低發(fā)病率和死亡率。藥物防治066臨床診斷發(fā)熱施馬倫貝格病患者通常會出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，體溫可升高至40℃以上，持續(xù)數(shù)天至數(shù)周不等。腹瀉與脫水患者可能出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉，導(dǎo)致脫水和電解質(zhì)紊亂。腹瀉可呈水樣或伴有粘液和血液。神經(jīng)系統(tǒng)癥狀部分患者可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，如頭痛、肌肉疼痛、肢體無力等，嚴(yán)重者可出現(xiàn)意識障礙。6.1臨床癥狀觀察血清學(xué)檢測通過采集患者血液樣本，檢測特異性抗體以輔助診斷。常用的血清學(xué)檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和間接免疫熒光試驗（IFA）。病原學(xué)檢測通過分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測病毒核酸，以確定病原體存在。病毒分離與鑒定將患者樣本接種到敏感細(xì)胞或?qū)嶒瀯游锷?，進(jìn)行病毒分離與鑒定，為確診提供直接證據(jù)。0102036.2實驗室檢測VS綜合患者的流行病學(xué)史、臨床癥狀、實驗室檢測結(jié)果等信息，由專業(yè)醫(yī)生進(jìn)行綜合分析，作出診斷。鑒別診斷施馬倫貝格病需與其他類似癥狀的傳染病進(jìn)行鑒別診斷，如流感、登革熱等。通過詳細(xì)的病史詢問、體格檢查和實驗室檢測，以明確診斷。診斷依據(jù)6.3診斷依據(jù)與鑒別診斷根據(jù)患者病情輕重和臨床表現(xiàn)，可分為輕型、普通型、重型和危重型等不同的臨床分型，以便針對性地采取治療措施。施馬倫貝格病可分為急性期、恢復(fù)期和后遺癥期。不同分期患者的臨床表現(xiàn)和治療重點有所不同，需密切關(guān)注病情變化，及時調(diào)整治療方案。臨床分型臨床分期6.4臨床分型與分期077樣品采集與處理在病程早期，患者出現(xiàn)癥狀后的最短時間內(nèi)采集樣品，以提高檢測的準(zhǔn)確性。采集時間根據(jù)臨床表現(xiàn)和疑似感染部位，選擇合適的樣品類型，如血液、組織等。采集部位確保采集足夠的樣品量，以滿足后續(xù)檢測的需要。采集數(shù)量在采集過程中，應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，避免交叉污染。無菌操作樣品采集要求血液樣品處理將采集的血液樣品進(jìn)行離心分離，取上清液進(jìn)行后續(xù)檢測。組織樣品處理將采集的組織樣品進(jìn)行研磨或勻漿處理，釋放病毒粒子，方便后續(xù)檢測。保存與運(yùn)輸樣品在采集后應(yīng)妥善保存，并在規(guī)定時間內(nèi)送至實驗室進(jìn)行檢測，以確保樣品的穩(wěn)定性和可靠性。樣品處理方法樣品接收與登記實驗室在收到樣品后應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)登記，包括樣品來源、采集時間等信息。核酸提取與純化采用合適的核酸提取方法，從樣品中提取病毒核酸，并進(jìn)行純化，以提高檢測的靈敏度。PCR擴(kuò)增與檢測利用特異性引物對提取的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過電泳或熒光定量等方法檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，以確定病毒的存在。實驗室檢測流程結(jié)果解讀根據(jù)PCR擴(kuò)增和檢測結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)史，對樣品進(jìn)行綜合解讀，確定是否感染施馬倫貝格病。0102報告出具實驗室在檢測完成后應(yīng)及時出具檢測報告，明確標(biāo)注檢測結(jié)果和解讀意見，為臨床診斷和治療提供有力支持。檢測結(jié)果解讀與報告088實驗室診斷病毒鑒定通過特異性抗體中和試驗、電子顯微鏡觀察、基因測序等方法對分離到的病毒進(jìn)行鑒定。病原學(xué)檢測的意義病原學(xué)檢測是確診施馬倫貝格病的金標(biāo)準(zhǔn)，能夠直接檢測到病毒的存在，為后續(xù)防控工作提供有力支持。病毒分離采用細(xì)胞培養(yǎng)方法對施馬倫貝格病毒進(jìn)行分離，可使用易感細(xì)胞系如BHK-21、Vero等。8.1病原學(xué)檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）利用特異性抗原抗體反應(yīng)原理，檢測血清中施馬倫貝格病毒特異性抗體。血清中和試驗（SNT）通過測定血清中中和抗體滴度，評估機(jī)體對施馬倫貝格病毒的抵抗力。血清學(xué)檢測的應(yīng)用血清學(xué)檢測可用于施馬倫貝格病的流行病學(xué)調(diào)查、疫苗免疫效果評價等方面。8.2血清學(xué)檢測0302018.3分子生物學(xué)檢測采用特異性引物對施馬倫貝格病毒核酸進(jìn)行擴(kuò)增，通過電泳等方法判斷結(jié)果。實時熒光定量PCR（qPCR）在PCR基礎(chǔ)上加入熒光探針，實時監(jiān)測擴(kuò)增過程，提高檢測靈敏度和特異性。分子生物學(xué)檢測的優(yōu)勢分子生物學(xué)檢測具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點，適用于大量樣品的快速篩查和診斷。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）099綜合判定判定原則01綜合考慮流行病學(xué)、臨床癥狀、病理學(xué)變化和實驗室檢測結(jié)果進(jìn)行判定。02區(qū)分自然感染與疫苗接種后的抗體反應(yīng)。排除其他類似疾病的干擾。0301020304收集病例資料包括病畜的基本信息、臨床表現(xiàn)、剖檢變化等。實驗室檢測進(jìn)行病原學(xué)、血清學(xué)等檢測，獲取客觀數(shù)據(jù)。結(jié)果分析結(jié)合病例資料和實驗室檢測結(jié)果，進(jìn)行綜合分析。作出判定根據(jù)分析結(jié)果，判定是否為施馬倫貝格病。判定流程010203確保樣品的真實性和可靠性，避免誤判。嚴(yán)格遵守實驗室操作規(guī)程，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于疑似病例，應(yīng)及時上報并采取措施防止疫情擴(kuò)散。判定注意事項10附錄A(規(guī)范性)病毒分離及血清中和試驗相關(guān)溶液的配制病毒稀釋液采用適宜的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液，用于病毒的稀釋與保存。病毒滅活液配制能夠滅活病毒的溶液，如含特定濃度甲醛或β-丙內(nèi)酯的溶液，以確保操作安全。細(xì)胞培養(yǎng)液根據(jù)特定細(xì)胞系的需求，配制適宜的培養(yǎng)液，通常包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、抗生素等成分。病毒分離相關(guān)溶液配制ABCD血清中和試驗相關(guān)溶液配制血清稀釋液選擇適當(dāng)?shù)木彌_液，如生理鹽水或磷酸鹽緩沖液，用于稀釋待測血清。細(xì)胞維持液在血清中和試驗過程中，用于維持細(xì)胞生長的溶液，通常包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和必要的添加劑。病毒-血清混合液將已知濃度的病毒與稀釋后的血清按一定比例混合，用于后續(xù)的血清中和試驗。染色液與洗滌液用于細(xì)胞染色與洗滌的溶液，以便觀察病毒中和效果及細(xì)胞狀態(tài)。11附錄B(資料性)熒光RT-PCR引物和探針序列信息特異性引物應(yīng)具有高特異性，以確保僅擴(kuò)增目標(biāo)病毒核酸序列，避免非特異性擴(kuò)增。敏感性引物設(shè)計應(yīng)兼顧敏感性，能夠在低病毒載量樣本中有效擴(kuò)增目標(biāo)序列。長度與GC含量引物長度適中，通常為18-24個核苷酸，GC含量控制在40%-60%之間，以保證引物的穩(wěn)定性和擴(kuò)增效率。引物設(shè)計原則探針的5’端通常標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，以實現(xiàn)實時熒光檢測。熒光標(biāo)記序列特異性長度與Tm值探針序列應(yīng)位于目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部，且具有高度特異性，以避免與非目標(biāo)序列雜交。探針長度適中，通常為20-30個核苷酸，Tm值（解鏈溫度）應(yīng)高于引物的Tm值，以確保在擴(kuò)增過程中探針與目標(biāo)序列的穩(wěn)定結(jié)合。探針設(shè)計要點表中詳細(xì)列出了針對施馬倫貝格病病毒的熒光RT-PCR引物和探針的序列信息，包括引物/探針名稱、序列、長度、GC含量等關(guān)鍵參數(shù)。這些引物和探針經(jīng)過嚴(yán)格篩選和優(yōu)化，可用于施馬倫貝格病病毒的高效、特異和敏感檢測。使用者可根據(jù)實際需求，選擇合適的引物和探針組合進(jìn)行熒光RT-PCR檢測。引物與探針序列信息表12附錄C(規(guī)范性)DEPC處理水的配制DEPC滅活RNA酶DEPC（焦碳酸二乙酯）是一種強(qiáng)烈的RNA酶抑制劑，能夠有效滅活水中的RNA酶，保證RNA的完整性。穩(wěn)定性好DEPC處理水在配制后能夠保持較長時間的穩(wěn)定性，不易被污染，滿足實驗需求。配制原理包括DEPC、去離子水、容量瓶、磁力攪拌器等。準(zhǔn)備試劑與耗材在通風(fēng)櫥中，將DEPC加入去離子水中，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解，然后靜置過夜，使其充分作用。配制過程將DEPC處理水進(jìn)行高壓滅菌，以去除殘留的DEPC，同時保證水的無菌狀態(tài)。高壓滅菌010203配制步驟安全防護(hù)DEPC具有揮發(fā)性，對人體有一定的毒性，配制過程中需佩戴防護(hù)眼鏡和手套，確保安全。準(zhǔn)確配制按照規(guī)定的比例加入DEPC和去離子水，確保配制出符合要求的DEPC處理水。儲存條件將配制好的DEPC處理水儲存于密封容器中，放置陰涼干燥處，避免陽光直射。注意事項用于RNA的提取、純化、保存等分子生物學(xué)實驗操作，確保RNA的質(zhì)量和穩(wěn)定性。分子生物學(xué)實驗在醫(yī)學(xué)研究與診斷中，使用DEPC處理水可以避免RNA酶的干擾，提高實驗的準(zhǔn)確性和可靠性。醫(yī)學(xué)研究與診斷應(yīng)用范圍13附錄D(規(guī)范性)阻斷ELISA抗體檢測相關(guān)溶液的配制磷酸鹽緩沖液（PBS）用于稀釋抗原、抗體及洗滌酶標(biāo)板，確保反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。配制方法取適量磷酸鹽，加入蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，定容后高壓滅菌。配制緩沖液包被液用于稀釋抗原并包被酶標(biāo)板，提供良好的抗原吸附環(huán)境。配制方法通常采用碳酸鹽緩沖液，取適量碳酸鹽加入蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH值至9.6左右。封閉液用于封閉酶標(biāo)板上未吸附抗原的位點，減少非特異性吸附。配制方法常用牛血清白蛋白（BSA）或脫脂奶粉溶于PBS中制成。包被液與封閉液抗體稀釋液用于稀釋待檢血清中的抗體，確?？贵w與抗原的特異性結(jié)合。配制方法通常采用含有一定量BSA的PBS，以提供穩(wěn)定的抗體活性。酶標(biāo)抗體稀釋液用于稀釋酶標(biāo)記的抗體，使其與待檢血清中的抗體形成競爭結(jié)合。配制方法在抗體稀釋液的基礎(chǔ)上加入適量的酶標(biāo)記抗體，確保酶的活性與穩(wěn)定性。抗體稀釋液與酶標(biāo)抗體稀釋液底物液用于與酶發(fā)生顯色反應(yīng)，生成可觀測的有色產(chǎn)物。終止液用于終止酶與底物的顯色反應(yīng)，固定反應(yīng)結(jié)果。配制方法根據(jù)具體酶標(biāo)抗體的類型選擇合適的底物，如TMB（四甲基聯(lián)苯胺）等，溶于有機(jī)溶劑后按比例加入底物緩沖液。配制方法通常采用硫酸或鹽酸等強(qiáng)酸，按一定比例加入蒸餾水制成。注意終止液加入時要迅速且均勻，以避免對反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生影響。底物液與終止液14附錄E(資料性)血清中和試驗(噬斑減少中和試驗)測定示例試驗原理血清中和試驗是一種基于病毒與特異性抗體結(jié)合后失去感染性的原理，通過檢測血清中特異性抗體對病毒的中和能力來評估免疫效果或診斷病毒感染的方法。噬斑減少中和試驗是血清中和試驗的一種，它利用病毒在細(xì)胞培養(yǎng)物上形成的噬斑數(shù)量來定量測定血清中抗體的中和效價。病毒稀釋與接種將已知滴度的病毒液進(jìn)行系列稀釋，與待測血清混合，接種于細(xì)胞培養(yǎng)物上。計算中和效價通過比較不同稀釋度血清對病毒噬斑形成的抑制作用，計算出待測血清的中和效價。觀察噬斑形成在適當(dāng)條件下培養(yǎng)一段時間后，觀察并記錄噬斑的數(shù)量。準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)物選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系，如Vero細(xì)胞等，進(jìn)行培養(yǎng)。操作步驟實驗室安全進(jìn)行病毒相關(guān)試驗