生物制藥 習(xí)題答案

第一章緒論一、生物技術(shù)藥物分為哪些類型？應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造的多肽、蛋白質(zhì)類基因藥物來(lái)自動(dòng)物、植物和微生物的天然生物藥物合成與部分合成的生物藥物二、生物技術(shù)藥物的特性分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜具有種屬特異性治療針對(duì)性強(qiáng)，療效高穩(wěn)定性差基因穩(wěn)定性免疫原性體內(nèi)的半衰期短受體效應(yīng)多效應(yīng)和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)檢驗(yàn)的特殊性三、生物技術(shù)制藥的特征是什么？高技術(shù)高投入長(zhǎng)周期高風(fēng)險(xiǎn)高收益

第二章基因工程制藥基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)有哪些？利用基因工程技術(shù)可以大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，為臨床使用提供有效的保障?？梢蕴峁┳銐驍?shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理、生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍。利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)和挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對(duì)生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價(jià)值。利用基因工程技術(shù)可以獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來(lái)源?；蚬こ趟幬镏圃斓闹饕绦蛴心男糠蛛x目的基因，目的基因與載體連接構(gòu)建DNA重組體，將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌，工程菌發(fā)酵，目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，產(chǎn)品的檢驗(yàn)利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽首先需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？目的基因來(lái)源于原核細(xì)胞，可選用合適的限制性核酸內(nèi)切酶切下目的基因。目的基因來(lái)源于真核細(xì)胞，常用的方法有：反轉(zhuǎn)錄法：為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì)多肽的DNA序列，可以從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì)mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶Ⅰ作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。反轉(zhuǎn)錄PCR：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈（不需要合成cDNA第二鏈），再以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)?；瘜W(xué)合成法利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過(guò)程mRNA的純化從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總RNA，用寡聚脫氧胸苷(dT)纖維素柱從總RNA中提取純化mRNA。cDNA的合成以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，再用DNA聚合酶合成cDNA的雙鏈。cDNA克隆利用合適的連接方法，將產(chǎn)生的雙鏈cDNA片段插入到合適的載體中。構(gòu)建cDNA文庫(kù)將cDNA于載體連接的重組體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，產(chǎn)生的克隆群體為cDNA文庫(kù)。從cDNA文庫(kù)中篩選目的基因得到cDNA文庫(kù)后，通常采用核酸探針雜交法和免疫反應(yīng)鑒定法從數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA片段中篩選出目的基因。宿主菌的選擇 目的基因獲得后，必須在合適的宿主菌中表達(dá)，才能獲得目的產(chǎn)物。宿主菌應(yīng)滿足以下要求：具有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；能利用易得廉價(jià)原料；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；容易進(jìn)行代謝調(diào)控；容易進(jìn)行重組DNA技術(shù)；產(chǎn)物容易提取純化。 基因表達(dá)的宿主細(xì)胞分為兩大類，第一類是原核細(xì)胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；第二類為真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)所用的表達(dá)載體必須具備哪些條件？載體能夠獨(dú)立的復(fù)制；具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記,且克隆位點(diǎn)應(yīng)在啟動(dòng)子序列后，以便外源基因表達(dá)；具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子，能為大腸桿菌的RNA酶識(shí)別；具有阻遏子，使啟動(dòng)子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；具有很強(qiáng)的終止子，使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無(wú)關(guān)的基因；所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號(hào)，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。七、影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素有哪些？1.外源基因的拷貝數(shù)：與載體在宿主中的拷貝數(shù)直接相關(guān)2.外源基因的表達(dá)效率：A、啟動(dòng)子的強(qiáng)弱：目的基因插入表達(dá)載體強(qiáng)啟動(dòng)子的下游，增加基因的表達(dá)水平B、核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性C、SD序列和起始密碼的間距D、密碼子組成：設(shè)計(jì)引物或合成基因時(shí)選擇大腸桿菌“偏愛(ài)”的密碼子3.表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性4.細(xì)胞的代謝負(fù)荷5.工程菌的培養(yǎng)條件八、真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式有哪些？1.以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的一種簡(jiǎn)便方法是使其表達(dá)為一種融合蛋白的一部分，這種融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，這樣的蛋白質(zhì)是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起的。2.以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。3.分泌型表達(dá)蛋白藥物基因外源蛋白的分泌表達(dá)是通過(guò)將外源基因融合到編碼原核蛋白信號(hào)肽序列的下游而實(shí)現(xiàn)的。九、質(zhì)粒不穩(wěn)定分為哪兩類，如何解決質(zhì)粒的不穩(wěn)定性？工程菌在傳代過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。分裂不穩(wěn)定：指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定：外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排、缺失所致工程菌性能的改變。選擇合適的宿主菌選擇合適的載體施加選擇壓力分階段控制培養(yǎng)控制培養(yǎng)條件固定化十、用于分離純化的技術(shù)應(yīng)滿足哪些要求？技術(shù)條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高的純化倍數(shù)；收率要高；兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整，這樣可減少工藝步驟；整個(gè)分離純化過(guò)程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。十一、分離純化常用的色譜分離方法有哪些？它們的原理是什么？ 分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過(guò)程精制階段的常用手段，優(yōu)點(diǎn)是具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等有害效應(yīng)。常用的色譜分離技術(shù)有離子交換層析、疏水層析、親和層析、凝膠過(guò)濾層析、高效液相層析等。離子交換層析是通過(guò)帶電的溶質(zhì)分子與離子交換劑中可交換的離子進(jìn)行交換，從而達(dá)到分離目的。疏水層析是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水基團(tuán)相互作用力的差異，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離。親和層析是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力而達(dá)到分離純化目的。凝膠過(guò)濾層析是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對(duì)溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。十二、分離純化工藝應(yīng)遵循哪些原則？具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性；盡可能減少組成