血液中45種有毒生物堿成分的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)方法

血液中45種有毒生物堿成分的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)方法本技術(shù)規(guī)范規(guī)定了血液中45種有毒生物堿成分（見(jiàn)附錄A）的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢驗(yàn)方法。本技術(shù)規(guī)范適用于血液中45種有毒生物堿成分的定性定量分析。也適用于尿液及體外樣品、可疑物證中45種有毒生物堿的定性分析。2規(guī)范性引用文件下列文件中對(duì)本技術(shù)規(guī)范的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本技術(shù)規(guī)范。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本技術(shù)規(guī)范。GA/T122毒物分析名詞術(shù)語(yǔ)GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義GA/T122中界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本技術(shù)規(guī)范。4原理本法利用45種有毒生物堿成分可在堿性條件下被有機(jī)溶劑從血液中提取出來(lái)的特點(diǎn)，以SKF525A為內(nèi)標(biāo)，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)與平行操作的有毒生物堿對(duì)照品比較，以保留時(shí)間、兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行定性分析；以定量離子對(duì)峰面積為依據(jù)，內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量。5試劑和儀器5.1試劑5.1.1乙腈。5.1.2甲酸：優(yōu)級(jí)純。5.1.3甲醇。5.1.4乙醚：分析純。5.1.5乙酸銨。5.1.6超純水：由純水系統(tǒng)制得，電阻率>18.2MΩ·cm。5.1.7pH9.2硼砂緩沖液。5.1.8流動(dòng)相緩沖液：20mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液：分別稱取1.54g乙酸銨和1.84g甲酸置于1000mL容量瓶中，加水定容至刻度，pH值約為4。25.1.945種有毒生物堿對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別精密稱取45種有毒生物堿對(duì)照品各適量，用甲醇配成1.0mg/mL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置冰箱中冷凍保存，保存時(shí)間為12個(gè)月。試驗(yàn)中所用其它濃度的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液均從上述儲(chǔ)備液用甲醇稀釋而得。5.1.10內(nèi)標(biāo)物SKF525A對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取SKF525A適量，用甲醇配制成1.0mg/mLSKF525A對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置冰箱中冷凍保存，保存時(shí)間為12個(gè)月。將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋得5μg/mLSKF525A內(nèi)標(biāo)工作液，置冰箱中冷藏保存，保存時(shí)間為6個(gè)月。5.2儀器5.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）。5.2.2分析天平：感量0.1mg。5.2.3渦旋混合器。5.2.4離心機(jī)。5.2.5精密移液器。5.2.6恒溫水浴鍋。6測(cè)定步驟6.1樣品預(yù)處理6.1.1待測(cè)樣品取待測(cè)血液1mL，加5μg/mLSKF525A內(nèi)標(biāo)工作液10μL，加1mLpH9.2硼砂緩沖液后，用乙醚3mL提取，渦旋混合，離心，將乙醚層轉(zhuǎn)移至另一試管中，同法提取兩次，合并乙醚液，置60°C水浴中揮干，殘留物用100μL流動(dòng)相（乙腈∶流動(dòng)相緩沖液=70∶30)定容，供LC-MS/MS分析。6.1.2空白樣品取空白血液1mL，按“6.1.1”項(xiàng)下進(jìn)行操作和分析。6.1.3添加樣品取空白血液1mL，添加待測(cè)樣品中出現(xiàn)的可疑有毒生物堿對(duì)照品，按“6.1.1”項(xiàng)下進(jìn)行操作和分6.2測(cè)定6.2.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀參考條件a）液相色譜柱：CapcellPakC18（250mm根2.0mm，MGⅡ5μm）或相當(dāng)者；b）柱溫：室溫；c）流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(流動(dòng)相緩沖液)=70∶30；d）流速：200μL/min；e）進(jìn)樣量：5μL；f）離子源：電噴霧電離-正離子模式(ESI+)；g）檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；h)離子源電壓（IS）：5500V；i）碰撞氣(CAD)、氣簾氣(CUR)、霧化氣(GS1)、輔助氣2(GS2)均為高純氮?dú)?，使用前調(diào)節(jié)各氣流流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測(cè)要求；3j）各成分去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等電壓值應(yīng)優(yōu)化至最佳靈敏度（見(jiàn)附錄A）。6.2.2定性分析定性分析以兩對(duì)母離子/子離子對(duì)進(jìn)行（見(jiàn)附錄A）。如果待測(cè)樣品出現(xiàn)某一有毒生物堿兩對(duì)母離子/子離子對(duì)的特征色譜峰，保留時(shí)間與添加樣品中相應(yīng)對(duì)照品的色譜峰保留時(shí)間比較，相對(duì)誤差在土2%內(nèi)，且所選擇的離子對(duì)相對(duì)豐度比與添加對(duì)照品的離子對(duì)相對(duì)豐度比之相對(duì)誤差不超過(guò)表1規(guī)定的范圍，則可認(rèn)為待測(cè)樣品中檢出此種有毒生物堿成分。表1相對(duì)離子對(duì)豐度比的最大允許相對(duì)誤差(%)6.2.3定量分析6.2.3.1定量方法根據(jù)待測(cè)樣品中有毒生物堿的濃度情況，用空白血液添加相應(yīng)有毒生物堿對(duì)照品，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法，以定量離子對(duì)峰面積進(jìn)行定量測(cè)定。定量方法可采用工作曲線法或單點(diǎn)校正法。采用工作曲線法時(shí)待測(cè)樣品中有毒生物堿的濃度應(yīng)在工作曲線的線性范圍內(nèi)。配制系列濃度的有毒生物堿血液質(zhì)控樣品，按“6.1.1”進(jìn)行樣品處理，按“6.2.1”條件進(jìn)行測(cè)定，以有毒生物堿和內(nèi)標(biāo)定量離子對(duì)峰面積比（或有毒生物堿定量離子對(duì)峰面積）為縱坐標(biāo)，血液中有毒生物堿濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，用工作曲線對(duì)待測(cè)樣品中有毒生物堿濃度進(jìn)行定量。采用單點(diǎn)校正法時(shí)待測(cè)樣品中有毒生物堿的濃度應(yīng)在添加樣品中有毒生物堿濃度的土50%內(nèi)。6.2.3.2結(jié)果計(jì)算6.2.3.2.1內(nèi)標(biāo)-工作曲線法在系列濃度的有毒生物堿血液質(zhì)控樣品中，以有毒生物堿與內(nèi)標(biāo)SKF525A定量離子對(duì)的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)、有毒生物堿質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程。根據(jù)待測(cè)樣品中有毒生物堿與內(nèi)標(biāo)SKF525A定量離子對(duì)峰面積比，按公式（1）計(jì)算出待測(cè)樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度。Yab………………式中：C——待測(cè)樣品中有毒生物堿質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；Y——待測(cè)樣品中有毒生物堿與內(nèi)標(biāo)峰面積比；a——線性方程的截距；b——線性方程的斜率。6.2.3.2.2內(nèi)標(biāo)-單點(diǎn)校正法根據(jù)待測(cè)樣品及添加樣品中有毒生物堿與內(nèi)標(biāo)SKF525A定量離子對(duì)峰面積比，按公式（2）計(jì)算出待測(cè)樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度。4AxAxcA,xAi………………式中：C——待測(cè)樣品中有毒生物堿質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；A——待測(cè)樣品中有毒生物堿的峰面積；A添加樣品中有毒生物堿的峰面積；Ai——待測(cè)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ai添加樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；c——添加樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)。6.2.3.2.3外標(biāo)-工作曲線法在系列濃度的有毒生物堿血液質(zhì)控樣品中，以有毒生物堿定量離子對(duì)的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、有毒生物堿質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程。根據(jù)待測(cè)樣品中有毒生物堿定量離子對(duì)峰面積，按公式（3）計(jì)算出待測(cè)樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度。C=Ya………………（3）b式中：C——待測(cè)樣品中有毒生物堿質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；Y——待測(cè)樣品中有毒生物堿的峰面積；a——線性方程的截距；b——線性方程的斜率。6.2.3.2.4外標(biāo)-單點(diǎn)校正法根據(jù)待測(cè)樣品及添加樣品中有毒生物堿定量離子對(duì)峰面積，按公式（4）計(jì)算出待測(cè)樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度。AxcA,………………式中：C——待測(cè)樣品中有毒生物堿質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；A——待測(cè)樣品中有毒生物堿的峰面積；A添加樣品中有毒生物堿的峰面積；c——添加樣品中有毒生物堿的質(zhì)量濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)。6.2.3.3平行試驗(yàn)待測(cè)樣品同時(shí)平行測(cè)定兩份，雙樣相對(duì)相差按公式（5）計(jì)算：RD（%）=—————x100………………（5）C式中：RD——相對(duì)相差；C1、C2——兩份待測(cè)樣品平行定量測(cè)定的質(zhì)量濃度；C——兩份待測(cè)樣品平行定量測(cè)定質(zhì)量濃度的平均值。6.2.4空白試驗(yàn)用空白血液進(jìn)行空白試驗(yàn)。7結(jié)果評(píng)價(jià)7.1定性結(jié)果評(píng)價(jià)7.1.1陰性結(jié)果評(píng)價(jià)如果待測(cè)樣品中僅檢出內(nèi)標(biāo)SKF525A未檢出附錄A中45種有毒生物堿成分，則陰性結(jié)果可靠；如果待測(cè)樣品中未檢出內(nèi)標(biāo)，則陰性結(jié)果不可靠