動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝

第十七章

動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝動物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝17.1制藥動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征一、動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能二、制藥動物細(xì)胞的種類三、生產(chǎn)用細(xì)胞系四、動物細(xì)胞的生產(chǎn)特征17.1制藥動物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)與特征1.動物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特征三羧酸循環(huán)2、動物細(xì)胞培養(yǎng)的代謝特征蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，以mRNA為模板，進(jìn)行密碼的翻譯。3、蛋白質(zhì)合成，糖基化修飾和分泌表達(dá)動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)蛋白質(zhì)糖基化修飾糖基化場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)，糖基結(jié)構(gòu)易變化。不同細(xì)胞系糖基化特征不同，根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)，選擇適宜細(xì)胞系。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)糖基化改造是研究熱點(diǎn)。糖基化蛋白質(zhì)分泌分泌泡與細(xì)胞膜融合，把產(chǎn)物釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞周期：細(xì)胞從分裂開始到分裂結(jié)束的一段時(shí)間。一個(gè)細(xì)胞分裂，形成兩個(gè)細(xì)胞。12－24h。4、細(xì)胞周期與凋亡四個(gè)階段：

M期：分裂期，很短，0.5～1h

分裂間期＝G1＋S＋G2期。G1期：DNA復(fù)制前期,差異大

S期：DNA合成期，6～8h

G2期：DNA復(fù)制后期，2～5h

細(xì)胞死亡的兩種方式：壞死：環(huán)境因素或病原物入侵，細(xì)胞受到嚴(yán)重傷害時(shí)快速膨脹，染色質(zhì)凝聚而死亡，細(xì)胞直接裂解。

特征是壞死過程不受細(xì)胞自主控制。細(xì)胞凋亡：細(xì)胞對環(huán)境變化作出的有計(jì)劃的、執(zhí)行預(yù)定程序的死亡應(yīng)答過程。特征是細(xì)胞收縮，細(xì)胞核和DNA斷裂，同時(shí)被膜包裹形成凋亡小體。4、細(xì)胞周期與凋亡動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)顯微鏡下凋亡的細(xì)胞形態(tài)反應(yīng)器中的死亡形式主要是凋亡不同細(xì)胞凋亡發(fā)生不同原因：缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生。細(xì)胞培養(yǎng)中需嚴(yán)格控制條件，防止細(xì)胞凋亡。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)5、制藥動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

5.1哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

5.2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)基于細(xì)胞來源：原代細(xì)胞，傳代細(xì)胞。基于細(xì)胞壽命：有限細(xì)胞系，無限細(xì)胞系?；诩?xì)胞的染色體數(shù)目：二倍體細(xì)胞系，異倍體細(xì)胞系?；讷@得方式：工程細(xì)胞系，癌變細(xì)胞系?；谏L特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型5.1哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1、細(xì)胞系的分類動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（1）有限細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)概念：細(xì)胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞就停止增殖。特點(diǎn)：保持充足的營養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再增加。大多數(shù)細(xì)胞：形成單層細(xì)胞，有少數(shù)懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（癌細(xì)胞）：無接觸抑制（2）無限細(xì)胞系概念是壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細(xì)胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。其特點(diǎn)：永生，沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求較低，倍增時(shí)間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（3）工程細(xì)胞系Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，批準(zhǔn)上市。產(chǎn)品逐漸淘汰。WI-38：WistarInstitute（WI），二倍體成纖維細(xì)胞系，壽命有限。貼壁生長，對很多病毒敏感，第一個(gè)被用于制備疫苗。MRC-5：二倍體成纖維細(xì)胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定抗性，用于制備疫苗。2、生產(chǎn)用細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（1）人源細(xì)胞系CHO細(xì)胞：Chinesehamsterovary特點(diǎn)：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的忍受能力。最為普遍和成熟表達(dá)糖基化蛋白藥物的細(xì)胞。多種衍生突變株，高表達(dá)。藥物：EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶I（2）哺乳動物細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)BHK－21：babyhamsterkidney，成纖維樣細(xì)胞，用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。上市重組凝血因子。Vero細(xì)胞系：非洲綠猴腎的成纖維細(xì)胞，多倍體核型，貼壁依賴性。VeroE6最為常用，可增殖多種病毒，生產(chǎn)疫苗。動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)（2）哺乳動物細(xì)胞系是脾臟B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞特點(diǎn)：無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達(dá)。應(yīng)用：抗體藥物生產(chǎn)。（3）雜交瘤細(xì)胞系動物細(xì)胞制藥表達(dá)系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒（載體）攜載外源基因，感染昆蟲細(xì)胞或幼蟲（宿主），高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)。1983：苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)1984：家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲表達(dá)系統(tǒng)。應(yīng)用：生產(chǎn)抗體、試劑盒等。日本批準(zhǔn)用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市。常用的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)：Sf21：來源于秋粘蟲的卵巢細(xì)胞。容易放大，高效表達(dá)。Sf9：從SF21中分離得到，最常用。抗機(jī)械剪切，無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長。TN-5B1-4：來源于粉紋夜蛾。表達(dá)能力高，能懸浮培養(yǎng)。5.2昆蟲表達(dá)系統(tǒng)家蠶完成基因組測序（西南大學(xué)完成）優(yōu)點(diǎn)：安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認(rèn)可易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快。高量表達(dá)：強(qiáng)啟動子，外源基因可超量表達(dá)；高效表達(dá)：可容納較大的外源基因（12kb），表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因，如抗體，并且裝配成有功能的分子。缺點(diǎn)：翻譯后的加工：昆蟲細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后的加工，但與哺乳動物細(xì)胞不完全相同；蛋白質(zhì)合成與加工不匹配，修飾效率可能不高，引起溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。重組率低，篩選困難，周期長，需要4－10d。2、優(yōu)點(diǎn)與不足表達(dá)系統(tǒng)對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格對培養(yǎng)基組成要求高天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物6.動物細(xì)胞的生產(chǎn)特征對培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格1、溫度2、氧氣3、pH值

對培養(yǎng)基組成要求高

天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物

生產(chǎn)工藝特征17.2基因工程動物細(xì)胞的構(gòu)建17.2.1表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建17.2.2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)17.2.3篩選與鑒定17.2.1表達(dá)載體的設(shè)計(jì)與構(gòu)建1、載體類型動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建動物病毒啟動子：SV40早期和晚期啟動子、腺病毒晚期啟動子、CMV立即早期基因啟動子。動物基因的啟動子：高表達(dá)，延長因子EF-1α啟動子、泛素蛋白C啟動子、IgG啟動子。2、

啟動子與復(fù)制子啟動子－－－編碼藥物基因－－－終止子，選擇標(biāo)記動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建終止密碼子:T(U)AA,T(U)AG,T(U)GA

PolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗。常用:SV40polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。3、終止子表達(dá)載體結(jié)構(gòu)舉例化學(xué)方法：磷酸鈣，樹脂，DEAE-葡聚糖物理方法：基因槍，顯微注射，電擊穿孔生物方法：病毒17.2.2轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建化學(xué)轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建磷酸鈣轉(zhuǎn)染電擊穿孔物理轉(zhuǎn)染病毒載體的轉(zhuǎn)染病毒感染細(xì)胞的過程：吸附，脫殼核酸進(jìn)入進(jìn)入細(xì)胞核整合動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建DNA合成途徑阻斷標(biāo)記，抗生素抗性標(biāo)記：篩選標(biāo)記與原理動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建選擇劑基因作用機(jī)理甲氨喋呤dhfr－二氫葉酸類似物，競爭性抑制DHFR活性。氨喋呤Tk＋抑制正常途徑dTTP合成5-溴脫氧尿苷Tk－阻斷dNTP正常合成途徑G418,Zeocinneo干擾核糖體，阻斷蛋白合成小結(jié)與思考題動物細(xì)胞培養(yǎng)制藥擴(kuò)增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d篩選培養(yǎng)：選擇性培養(yǎng)基,2-4d更換培養(yǎng)基，2－3周，獲得單克隆細(xì)胞集落。鑒定：對獨(dú)立集落進(jìn)行穩(wěn)定性、表達(dá)量、生物活性等鑒定。建庫：按生物制品要求，建立細(xì)胞系和建庫，妥善保存。動物細(xì)胞制藥細(xì)胞系構(gòu)建3、篩選與鑒定、建庫動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基組成成分培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基質(zhì)量控制動物細(xì)胞培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基組成成分1、糖類2、氨基酸3、維生素4、無機(jī)鹽類5、生長類因子與激素動物細(xì)胞培養(yǎng)的種類1、天然培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用2、合成培養(yǎng)3、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)量的控制1、培養(yǎng)用水質(zhì)2、緩沖液Ca,Mg離子具有細(xì)胞凝集作用3、生理鹽水和平衡鹽溶液3、生理鹽水和平衡鹽溶液4、氨基酸配制5、NaHCO3配制6、培養(yǎng)基滅菌動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動物細(xì)胞生長和基質(zhì)依賴性1、生長基質(zhì)2、貼壁依賴性細(xì)胞3、非貼壁依賴性細(xì)胞4、兼性貼壁依賴性細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)基本過程1、原代細(xì)胞培養(yǎng)—過程2、傳代細(xì)胞培養(yǎng)—過程動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1、單層貼壁培養(yǎng)—概念與過程1、單層貼壁培養(yǎng)—特點(diǎn)2、懸浮培養(yǎng)3、微載體培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng)90年代以來,醫(yī)學(xué)界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細(xì)胞的免疫隔離和運(yùn)載工具,利用重組細(xì)胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能,治療相關(guān)疾病。微囊化人胰島培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細(xì)胞培養(yǎng)0d微囊化肝癌細(xì)胞培養(yǎng)40d不同放大倍數(shù)的海藻酸鈣微膠囊的SEM照片不同放大倍數(shù)的殼聚糖/海藻酸鈉微膠囊的SEM照片重組人紅細(xì)胞生成素生產(chǎn)工藝重組人紅細(xì)胞