長裙竹蓀菌種培育技術規(guī)范

1長裙竹蓀菌種培育技術規(guī)范本文件規(guī)定了長裙竹蓀菌種的生產條件、生產工藝、質量要求、檢驗方法、標簽、包裝、運輸、貯存等技術要求。本文件適用于長裙竹蓀菌種生產。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運圖示標志GB/T4789.28食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質量要求GB/T5749（水質要求）并在文中體現(xiàn)GB38850消毒劑原料清單及禁限用物質NY/T528食用菌菌種生產技術規(guī)程NY5099無公害食品食用菌栽培基質安全技術要求食用菌菌種管理辦法中華人民共和國農業(yè)部（2006）第62號令3術語與定義下列術語和定義適用于本文件。3.1母種stockculture經選育出具有結實性的菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，也稱一級種。3.2原種pre-culturespawn由母種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱二級種。3.3栽培種spawn由原種移植、擴大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物，也稱三級種。3.4角變sector因菌絲體局部變異或感染病毒而導致菌絲變細、生長緩慢、菌絲體表面特征成角狀等異常的現(xiàn)象。3.5頡頏antagonism具有不同遺傳基因的菌落間產生不生長區(qū)帶或形成不同形式線性邊緣的現(xiàn)象。3.62高溫圈hightemperatureline食用菌菌種在生產過程中受高溫的不良影響，培養(yǎng)物出現(xiàn)的圈狀發(fā)黃、發(fā)暗或菌絲變稀弱等現(xiàn)象。3.7鎖狀聯(lián)合clampconnection食用菌不同性別的一級菌絲發(fā)生接合后，通過質配形成了由雙核構成二級菌絲，再形成喙狀突起而連和兩個細胞的方式后，不斷使雙核細胞分裂，從而使菌絲尖端不斷向前延伸的過程。3.8種性charactersofvariety食用菌對溫度、濕度、酸堿度、光線、氧氣等栽培條件的要求，以及抗逆性、豐產性、出菇遲早、出菇潮數(shù)、栽培周期、商品質量及栽培習性等農藝性狀。亦是品種特性的簡稱。4生產條件4.1技術人員按照中華人民共和國農業(yè)部（2006）第62號令《食用菌菌種管理辦法》的規(guī)定配備生產技術人員和檢驗人員。4.2場地環(huán)境應符合NY/T528的要求。4.3廠房設置與布局4.3.1應設設置能有效隔離的原材料庫、堆料場、配料分裝場、滅菌間、冷卻室、接種室、培養(yǎng)室、菌種檢驗室、菌種貯存室和出菇試驗場、廢物堆集場等設施。4.3.2廠房建造從結構和功能上應能滿足食用菌菌種生產的基本需要，應按照菌種制種工藝流程合理布局，各操作環(huán)節(jié)順序形成流水線。滅菌前的操作區(qū)域與滅菌后的操作區(qū)域應完全隔離，出菇場與菌種生產、培養(yǎng)車間應完全隔離。4.3.3堆料場、配料分裝場、廢物堆集場等帶有雜菌的區(qū)域應設置在下風口，盡可能遠離生產場地。4.4設施設備4.4.1基本設施4.4.1.1原材料庫應防潮防雨、通風、遠離火源。4.4.1.2堆料場可由若干水泥池并排構成，各池頂面應有開口、一側面有門，各排水泥池之間應便于機械化作業(yè)。4.4.1.3配料分裝場水電等應齊備，且空間充裕、通風良好，地面應便于沖洗。4.4.1.4滅菌間水電等應齊備，且空間充裕，能通風散熱，墻壁和地面應便于沖洗消毒。4.4.1.5接種室應配備降溫、除塵設備，四周墻面及屋頂、地面應光潔，能滿足清洗消毒要求。4.4.1.6培養(yǎng)室應具有與生產量相適應的面積和防蚊蟲、鼠害設施；應通風良好并無直射陽光，能密閉熏蒸消毒殺蟲；應有通風換氣和能實現(xiàn)18℃~28℃控溫要求的設備。4.4.1.7貯存室應具備0℃~15℃低溫貯存條件。4.4.1.8檢驗室水電等設備應齊備，能滿足安裝相應的檢驗設備和儀器等要求。4.4.2基本設備3培養(yǎng)接種培養(yǎng)接種應具備稱量用具、蒸煮設備、母種培養(yǎng)基分裝設備、拌料機、裝袋機、高壓滅菌和常壓滅菌設備、接種工具、接種箱或超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩培養(yǎng)箱（轉速170r/min以上，可控溫）、培養(yǎng)架、烘箱、除濕機、電冰箱、質量檢測儀器設備及其它工器具等設備。4.4.3消耗材料4.4.3.1培養(yǎng)料應符合NY5099的要求。4.4.3.2培養(yǎng)容器應具備以下器材及裝置：a)試管：玻璃試管，配套棉塞（梳棉制作）或硅膠塞等；b)三角瓶：500mL～2000mL規(guī)格，并配套大小適宜的棉塞、硅膠塞或透氣封口膜等可滿足濾菌和透氣要求的無棉塑料蓋封口。c)培養(yǎng)皿：90mm規(guī)格玻璃培養(yǎng)皿或一次性滅菌培養(yǎng)皿。d)玻璃瓶、塑料瓶、組培瓶：500mL～1000mL容積等規(guī)格，并附有能透氣的瓶塞。e)食用菌袋：根據(jù)滅菌方式對應選用聚乙烯（不透明，韌性較好，只能常壓滅菌）或聚丙烯食用菌（透明，韌性較差，可高壓滅菌）等材質。4.4.3.3消毒材料及藥品應配備紫外燈、75%酒精、石炭酸（苯酚）、來蘇兒、漂白粉、波爾多液、石灰等消毒材料，并配備符合GB38850要求的二氧異氰尿酸鈉等主要成分的消毒劑。5生產工藝5.1母種5.1.1母種來源應是經兩年以上栽培的、種性合格的長裙竹蓀（Dictyophoraindusiata(Vent.Pers.)Fisch.）斜面菌種，正常條件下生物學效率應不低于10%。5.1.2工藝流程工藝流程應按圖1要求。培養(yǎng)基制備圖1母種生產工藝流程圖5.1.3培養(yǎng)基制備5.1.3.1培養(yǎng)基制作所用原材料應符合NY5099的要求，推薦按附錄A要求。5.1.3.2滅菌4培養(yǎng)基配制完成后應在1h內滅菌，在0.11MPa～0.12MPa條件下滅菌30min；滅菌完畢自然降壓至零，不應強制降壓。5.1.3.3擺斜面滅菌結束后應及時開蓋，自然降溫20min～30min，并利用余熱烘干棉塞；再將試管的一端斜放在厚度約1cm、頂端距試管口40mm～50mm的斜面木條上。5.1.3.4滅菌效果檢查將制好的母種斜面培養(yǎng)基隨機抽取3%～5%的試管量，直接置于28℃恒溫培養(yǎng)；待48h后檢查，無微生物長出的為滅菌合格。5.1.4接種5.1.4.1接種室（箱）或超凈工作臺的消毒5.1.4.1.1應采用符合GB38850要求的氣霧消毒劑（包括但不限于以二氧異氰尿酸鈉為主要成分的各種商品消毒劑）熏蒸。5.1.4.1.2操作臺面應先用75%酒精或其它消毒劑擦拭消毒，并用紫外燈照射30min后接種。5.1.4.1.3接種室應熏蒸2h～3h后，再進接種箱熏蒸40min。5.1.4.2接種操作5.1.4.2.1應檢查、核對菌種。5.1.4.2.2應用75%酒精棉球擦拭消毒，接種針和母種試管口應用酒精燈火焰消毒。5.1.4.2.3待接種針經火焰消毒并冷卻后，切取（3mm～5mm）×（3mm～5mm）的任一母種快速轉接進待接試管斜面中央；同時，應塞好試管塞、貼好標簽。5.1.5培養(yǎng)接種后應置于22℃~28℃的恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng)直至長滿斜面，期間應密切觀察并及時揀出污染菌種。5.2原種5.2.1固體原種5.2.1.1工藝流程應按本文件5.1.2執(zhí)行。5.2.1.2培養(yǎng)基制備5.2.1.2.1培養(yǎng)基配方宜采用附錄B中所列培養(yǎng)基配方，所用原材料應符合NY5099的要求。竹屑或木屑等顆粒較大，吸水較慢的原材料應要進行預濕處理；其間應加水浸泡24h，并中途換水1次～2次。5.2.1.2.2制作方法5按照配方量取相應原材料放入攪拌機內混合，加入糖和石灰等應溶入水中，控制含水量在60%～65%10mm處，稍作壓實，上緊下松，松緊適度。將瓶口和外瓶壁洗擦干凈，封瓶口。5.2.1.2.3滅菌菌種裝瓶后應置于滅菌鍋滅菌。當滅菌鍋壓力升到0.05Mpa時，應及時打開放汽閥排放冷氣，直至鍋內冷空氣排凈。待壓力升至0.14MPa開始計時，再滅菌2.5h～3.0h。滅菌完畢后自然降壓，開鍋取出菌種瓶，移入預先清潔和消毒的冷卻室或接種室內，冷卻至25℃~28℃準備接種。5.2.1.3接種5.2.1.3.1接種環(huán)境消毒按本文件5.1.4.1執(zhí)行。5.2.1.3.2接種操作應核對菌種無誤后用于接種。接種人員的手應用75%酒精棉球擦拭消毒；母種試管口應在位于火焰上方無菌區(qū)域、不直接灼燒瓶口的位置用酒精燈火焰消毒。接種器具經火焰消毒并冷卻后，應切取12mm×12mm大小的任一母種快速接入原種瓶內并封好瓶口；每支母種接原種3瓶～5瓶。接種后應及時貼好標簽標識，做好接種場所的清潔衛(wèi)生并消毒。5.2.1.4培養(yǎng)培養(yǎng)室內應控制室溫在20℃~25℃、空氣相對濕度在60%～70%，保持空氣清新，避光培養(yǎng)。應定期檢查菌種萌發(fā)情況，及時揀出污染和不合格菌種。5.2.2液體原種5.2.2.1工藝流程按本文件5.1.2執(zhí)行。5.2.2.2培養(yǎng)基制備5.2.2.2.1培養(yǎng)基配方宜采用附錄B中B.5所列培養(yǎng)基配方，所用原材料應符合NY5099的要求，其中麥粒提取液的制作方式為：將麥粒稱量后用自來水常溫浸泡24h，經過濾后，再用干凈自來水淘洗3次；加麥粒質量4倍比的水后煮至麥粒無白心，冷卻過濾后備用。5.2.2.2.2配制方法取麥粒提取液按配方加入其他配料后，按比例配制400mL培養(yǎng)基，裝入1000mL容量的三角瓶中。5.2.2.2.3滅菌宜在121℃溫度時滅菌40min（或等同滅菌條件）。待滅菌鍋壓力歸零后，開鍋取出菌種瓶，移入預先清潔和消毒的冷卻室或接種室內冷卻。待冷卻至25℃~28℃準備接種。5.2.2.3接種65.2.2.3.1接種環(huán)境消毒按本文件5.1.4.1執(zhí)行。5.2.2.3.2接種操作挑取母種斜面菌絲少許到液體培養(yǎng)基中。一支裝有斜面母種的400mL液體培養(yǎng)基可接種3瓶～5瓶1000mL的三角瓶。5.2.2.4培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)箱應用安全型氣霧消毒劑（包括但不限于以二氧異氰尿酸鈉為主要成分的各種商品消毒劑）熏蒸1h～2h，再將已接種母種的三角瓶放置到溫度25℃、轉速170r/min振蕩箱中培養(yǎng)6d。5.3栽培種栽培種生產工藝宜參照以下路徑：——栽培種容器：可選用規(guī)格為15cm×30cm的折角聚丙烯菌種袋，或其它規(guī)格的菌種袋；——菌種袋裝料：袋面應平整無皺褶，袋內料面無空隙，松緊適度，用手輕壓袋面有彈性；——滅菌條件：聚丙烯菌袋可采用0.14Mpa，滅菌2h～3h，聚乙烯菌袋可采用0.11Mpa，滅菌3h～4h，栽培種也可采用常壓100℃,滅菌12h～16h，各滅菌方式均應自然降壓；——接種：原種瓶的瓶口內外和外瓶壁應用消毒液清洗消毒，固體原種瓶內的表層菌種和已形成原基的部分去掉不用，接種量為栽培種培養(yǎng)料體積的2%～3%，液體原種使用無菌吸管或針筒接種，接種量為栽培種培養(yǎng)料體積的0.25%～0.5%。5.4記錄生產各環(huán)節(jié)應詳細記錄。母種按品種記錄培養(yǎng)條件、接種時間、分批編號；原種、栽培種按菌種來源記錄制種方法、接種時間、分批編號。5.5入庫貯存5.5.1完成培養(yǎng)的菌種應及時登記入庫并在適齡期內使用。5.5.2母種應在4℃±2℃冰箱中貯存，貯存期不超過90d。5.5.3原種應及時使用。在溫度不宜超過20℃,清潔、通風、干燥（相對濕度50%～70%），避光的室內，液體原種的存放時間不應超過15d，固體原種不應超過30d。5.5.4栽培種應及時使用。通常情況下，在溫度不超過20℃,清潔、通風、干燥（相對濕度50%～70%避光的室內可貯存12個月；在20℃~25℃,清潔、通風、干燥（相對濕度50%～70%），避光的室內可貯存45d。6質量要求與檢驗方法6.1菌種質量要求6.1.1母種6.1.1.1生長速度7在PDA培養(yǎng)基上、22℃~28℃時，菌絲體可在15d～25d時間內長滿斜面。6.1.1.2感官質量應符合以下要求：——試管完好無損，試管塞干燥、潔凈、松緊適度，滿足透氣和濾菌要求?！泵骈L度為試管總長的1/3～1/2，頂端距試管塞40mm～50mm，菌落邊緣整齊，潔白、濃密、旺健、棉毛狀，均勻、舒展、平整、無角變，無分泌物，有具有長裙竹蓀菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味。——斜面培養(yǎng)基背面不干縮，顏色均勻、無暗斑、無色素。6.1.1.3顯微特征在400倍顯微鏡下可見菌絲粗壯、豐滿、均勻，有鎖狀聯(lián)合，無雜菌。6.1.2原種6.1.2.1固體原種6.1.2.1.1生長速度在采用適宜培養(yǎng)基，20℃~25℃培養(yǎng)條件下，80d～100d時間可長滿90%以上。6.1.2.1.2感官質量應符合以下要求：——容器完好無損，瓶塞干燥、潔凈、松緊適度，滿足透氣和濾菌要求?！萜鲀扰囵B(yǎng)基緊貼瓶（袋）壁，無干縮，菌絲體潔白濃密、生長旺健，生長均勻，上表面距瓶口10mm～30mm，無角變，無高溫圈及頡頏現(xiàn)象，菌絲培養(yǎng)物無肉眼可見的子實體原基?！砻鏌o分泌物，允許有少量無色或淺黃色水珠，有長裙竹蓀菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味。6.1.2.1.3顯微特征在400倍顯微鏡下可見菌絲粗壯、豐滿、均勻，有鎖狀聯(lián)合，無雜菌。6.1.2.2液體原種6.1.2.2.1生長速度母種應接種至裝有適宜液體培養(yǎng)基的500mL或1000mL三角瓶內，在25℃：2℃條件下，5d～7d應形成乳白色混濁的菌懸液。6.1.2.2.2感官質量菌絲球應均勻分散，有竹蓀菌種特有的清香味，無酸、臭、霉等異味。6.1.2.2.3理化指標菌絲球直徑應在0.1mm～0.5mm之間，培養(yǎng)基中菌絲干重應大于1.5g/100mL。6.1.3栽培種8菌絲出現(xiàn)脫壁但未見萎縮可正常使用。若出現(xiàn)菌絲發(fā)黃、萎縮甚至自溶產生滲濾液等現(xiàn)象則不能繼續(xù)使用。其余要求同本文件6.1.2.2。6.2抽樣、留樣6.2.1按批隨機抽取被檢樣品。母種、原種、栽培種的抽樣量分別為該批菌種量的10%、5%、1%，但每批抽樣數(shù)量不得少于10支（瓶/袋）；超過100支（瓶/袋）抽樣量的，可進行兩級抽樣，第一次按0.1%抽樣。6.2.2復檢時，應按6.2.1抽取1%樣品復檢。應98%以上合格。6.2.3各級菌種都應留樣備查，留樣的數(shù)量應每個批號3支（瓶、袋5支（瓶、袋）在0℃~15℃下貯存。留樣時間為母種5個月、原種4個月、栽培種2個月，或該批菌種正常生產條件下出菇后方可處置。6.3檢驗規(guī)則按質量要求進行，檢驗項目全部符合質量要求時，為合格菌種，其中任何一項不符合要求，均為不合格菌種。復檢按6.2.2判定。6.4檢驗方法6.4.1感官檢驗方法主要采用肉眼觀察，必要時借助放大鏡或顯微鏡觀察。6.4.2理化檢驗方法菌絲干重：100℃烘干至恒重時稱重，精確到0.001g。6.4.3農藝性狀和商品性狀應將被檢母種制成原種，檢驗其農藝性狀和商品性狀。宜采用附錄C規(guī)定的培養(yǎng)基配方，制作菌袋45個。接種后分3組（每組15袋）進行常規(guī)管理，根據(jù)表1所列項目，做好栽培記錄，統(tǒng)計檢驗結果。同時將該母種的出發(fā)菌株設為對照，做同樣處理。對比二者的檢驗結果，以時間計的檢驗項目中，被檢母種的任何一項時間較對照菌株推遲5天以上（含5天）者，為不合格，產量顯著低于對照菌株者，為不合格；菇體外觀形態(tài)與對照明顯不同或畸形者，為不合格。表1母種栽培中農藝性狀和商品發(fā)送檢驗記錄96.4.4微生物學檢驗方法不定期抽檢或母種、原種、栽培種質量異常情況下，需按下述方法進行微生物學檢驗：——菌絲生長狀態(tài)和鎖狀聯(lián)合：用放大倍數(shù)不低于400倍的光學顯微鏡觀察培養(yǎng)物的水封片，每一檢樣應觀察不少于20個視野?！毦鷻z驗：取少量疑有細菌污染的培養(yǎng)物，按無菌操作接種于GB/T4789.28中規(guī)定的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液中，25℃~28℃振蕩培養(yǎng)1d～2d，觀察培養(yǎng)液是否混濁，培養(yǎng)液混濁，為有細菌污染，培養(yǎng)液澄清，為無細菌污染?！咕鷻z驗：取少量疑有霉菌污染的培養(yǎng)物，按無菌操作接種于PD28℃培養(yǎng)3d～4d，出現(xiàn)白色以外色澤的菌落或非竹蓀菌絲形態(tài)菌落的，或有異味者為霉菌污染物，必要時進行水封片鏡檢。7標簽、包裝、運輸、貯存7.1標簽出售的菌種應貼標簽，注明竹蓀品種、級別、接種日期、生產單位、地址、電話、執(zhí)行標準。7.2包裝7.2.1母種的外包裝宜用木盒或有足夠強度的紙盒，原種和栽培種的外包裝可按購買方要求提供。7.2.2如需長途運輸，原種和栽培種還需根據(jù)GB/T191的相關要求提供不同規(guī)格的外包裝，如木箱、塑料箱或有足夠強度的紙箱，箱內除菌種外的空隙用輕質材料填滿塞牢。7.2.3每箱菌種根據(jù)GB/T191的要求，除貼有本文件7.1中所述標簽外，還應標明包裝數(shù)量、出廠日期、保質期及貯存條件等相關信息。7.3運輸運輸時不應與有毒有害物品混裝。氣溫達30℃以上時，需用2℃~20℃的冷藏車運輸。運輸中應有防震、防曬、防塵、防