流式細胞技術(shù)教材

流式細胞術(shù)

FLOWCYTOMETRY張華屏主要內(nèi)容流式細胞術(shù)的概念流式細胞儀的基本結(jié)構(gòu)流式細胞儀的工作原理流式細胞儀的結(jié)果顯示方式FCM在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用

流式細胞儀（FlowCytometer,FCM）是一項集激光技術(shù)、流體力學(xué)技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)以及細胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。概括來說，流式細胞術(shù)就是對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選的技術(shù)。

特點

（5）高純度分選技術(shù)

（1）測量速度快（2）高靈敏度（3）高精確度（4）多參數(shù)（多參數(shù)流動室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計算機和分析系統(tǒng)。待測細胞被制成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動下進入流動室，與水平方向的激光光束垂直相交，細胞受到強烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時產(chǎn)生散射光。細胞發(fā)出的熒光信號和散射光信號，同時被熒光光電倍增管接收，被積分放大反轉(zhuǎn)換為電子信號輸入電子信息接收器、通過計算機快速而精確地將所測數(shù)據(jù)計算出來，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實現(xiàn)了細胞的定量分析。散射信號在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0℃角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90℃角散射。這里所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。散射光信號—前向散射光FSC----Forward(AngelLight)Scatter

在激光束正前方的檢測器,為前向散射光檢測器

FSC的強度與細胞或其他顆粒的大小有關(guān)FSC用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性 如:大小前向角散射光

散射光信號–側(cè)向角散射光SSC-Side(AngelLight)Scatter

與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器,也稱為90度散射光檢測器

SSC的強度與細胞或其他顆粒的形狀及結(jié)構(gòu)的均勻度（opticalhomogeneity）

有關(guān)SSC用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu) 如:胞漿內(nèi)顆粒多少,核質(zhì)比側(cè)向散射光

熒光信號熒光信號主要包括兩部分①自發(fā)熒光，不經(jīng)熒光染色，細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光。②特征熒光，由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。

熒光信號每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長,并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長.利用各種不同波長的光學(xué)濾片來收集(檢測)這些光學(xué)信號熒光素種類FITC(異硫氰酸熒光素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)流式細胞儀的熒光信號數(shù)據(jù)顯示方式單參數(shù)直方圖雙參數(shù)二維點圖等高圖二維密度圖三維圖單參數(shù)直方圖（Histogram）X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細胞的頻率雙參數(shù)二維點圖二維等高圖和密度圖Pseudo3DPlot3DPlotFCM的數(shù)據(jù)分析：

相應(yīng)的分析軟件，如CellQuest

和ModFit

等流式細胞儀可測量的主要參數(shù)細胞結(jié)構(gòu)細胞大小細胞粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內(nèi)細胞因子酶活性激素結(jié)合位點細胞受體流式細胞儀的臨床應(yīng)用白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤細胞的周期和倍體分析網(wǎng)織紅細胞和網(wǎng)織血小板計數(shù)移植前的交叉配型和免疫狀態(tài)監(jiān)測干細胞計數(shù)血小板功能及相關(guān)疾病細胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用最廣泛也是最基本的領(lǐng)域，細胞周期分析是其基本分析內(nèi)容之一，而實施的技術(shù)途徑是通過測定細胞周期各時相的DNA含量來達到的。流式細胞術(shù)的應(yīng)用舉例眾所周知，細胞周期由G1期、S期、G2期和M期所構(gòu)成的。各期細胞的DNA含量如下：G1期為2C，G2期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G1峰的道數(shù)恰好是G2和M峰道數(shù)的一半。研究表明：對于正常細胞群，各周期時相的細胞數(shù)的比例是同一的；對于惡性病變的細胞群則是非均一的。G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEventsAtypicalDNAHistogramofcellproliferation2倍體異倍體4倍體腫瘤組織中的各種DNA倍體AnnexinVAssay能夠區(qū)分死亡與凋亡當(dāng)含細胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢測器的檢測:如果液滴中含有細胞就會激活干涉檢測器，只有帶有熒光標(biāo)記細胞的液滴才會激活熒光檢測器。當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的液滴通過激光束時，將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液帶上負電荷。由于液滴帶有負電荷，移動時就會向正極移動，進入到熒光標(biāo)記細胞收集器中。細胞分選的原理Fluore