高效液相色譜法及其在中藥分析中的應用

關于高效液相色譜法及其在中藥分析中的應用03.06.2024103.06.20242慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液第2頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.20243按溶質在分離過程中的原理：吸附色譜分配色譜離子交換色譜體積排阻色譜親和色譜液相色譜的分類第3頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.20244按色譜固定相的形式：平板色譜（平面色譜）柱色譜按分離的壓力高壓液相色譜（高效液相色譜）中壓液相色譜常壓液相色譜液相色譜的分類第4頁,共74頁，星期六，2024年，5月H－dp關系圖第5頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.20246一般也把吸附色譜法稱為液固色譜法。液固色譜法的固定相一般為固體吸附劑，常用的是：碳酸鈣、硅膠、氧化鋁、氧化鎂、活性炭等。其中硅膠最為常用。吸附色譜對中等分子量的油溶性樣品可獲得最佳的分離，而對強極性或離子型的樣品，有時會發(fā)生不可逆吸附，不能得到滿意的結果。液固色譜法第6頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.20247吸附劑一般為多孔性的物質，在它們的表明存在著分散的吸附中心，溶質分子和流動相分子在吸附劑表面的活性中心上進行競爭，同時不同溶質之間和同一溶質的不同官能團之間液也存在競爭。競爭的綜合結果就是形成不同溶質在吸附劑表面吸附、解吸平衡?；驹恚旱?頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.20248吸附解吸X表示溶質分子，下標m為流動相，s為固定相M表示流動相分子，下標m為流動相，s為固定相n為被溶質分子取代的流動相分子數(shù)目用一個式子表示如下：第8頁,共74頁，星期六，2024年，5月第9頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202410鍵合相固定相：在硅膠的表明用鍵合反應把官能基團鍵合到表面上，解決固定相流失的問題。正相色譜：流動相極性比固定相極性小反相色譜：流動相極性比固定相極性大鍵合相液相色譜第10頁,共74頁，星期六，2024年，5月第11頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202412高效液相色譜——固定相

化學鍵合相硅膠

octadecylSi-[CH2]17-CH3C18octylSi-[CH2]7-CH3C8cyanopropylSi-[CH2]3-CNCNaminopropylSi-[CH2]3-NH2NH2

第12頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202413固定相的其他性能

載體的形狀球形無定形粒徑3~10μm,1.7~2.5μm孔徑<150?分析分子量<2000的化合物;>300?分析分子量>2000的化合物表面積鍵合基團的表面覆蓋度含碳量第13頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202414一般認為鍵合相色譜的機理分配色譜機理，也有人認為它是吸附色譜機理，其實應該是有兩種成分在里面，現(xiàn)在又有疏溶劑理論等機理的提出。第14頁,共74頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜儀器第15頁,共74頁，星期六，2024年，5月第16頁,共74頁，星期六，2024年，5月儲存和輸送液體設備進樣系統(tǒng)柱系統(tǒng)檢測器控制和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第17頁,共74頁，星期六，2024年，5月選擇流動相的原則：保持色譜柱的穩(wěn)定性化學惰性適合所用的檢測器對樣品有一定的溶解能力清洗、更換方便、毒性小沸點、粘度等物理性質合適第18頁,共74頁，星期六，2024年，5月反相色譜最常用的流動相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、異丙醇等。水－甲醇體系：大約50％水的時候粘度最大水－乙腈體系：35％水的時候粘度最大。第19頁,共74頁，星期六，2024年，5月存放流動相的容器一定要惰性的，并且有機溶劑要避光。輸液泵要求流量平穩(wěn),可以調節(jié)的流量范圍寬，耐高壓。一般是柱塞往復泵。第20頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202421第21頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202422流動相的混合輸入和洗脫方式離線混合配制濾過脫氣

在線混合低壓在線混合高壓在線混合洗脫等度洗脫梯度洗脫第22頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202423高效液相色譜儀器——泵系統(tǒng)第23頁,共74頁，星期六，2024年，5月進樣系統(tǒng)包括手動進樣和自動進樣無論手動進樣還是自動進樣，都要通過六通閥。六通閥進樣是高壓系統(tǒng)的需要，既不影響系統(tǒng)的正常運行又能夠讓樣品進到系統(tǒng)中去。第24頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202425第25頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202426高效液相色譜儀器——進樣器第26頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202427反相鍵合相色譜柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。柱溫箱的溫度控制要求比較精確，因為流體的粘度受溫度的影響較大。柱系統(tǒng)包括色譜柱和柱溫箱第27頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202428測量原理不同分類：光學性質檢測器電學和電化學性質檢測器熱學性質檢測器液相色譜檢測器第28頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202429紫外－可見光檢測器示差折光檢測器熒光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器化學發(fā)光檢測器光學性質檢測器：第29頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202430高效液相色譜儀器——檢測器第30頁,共74頁，星期六，2024年，5月紫外吸收檢測器有三種類型：固定波長紫外吸收檢測器：低壓汞燈提供固定254nm或280nm紫外光。可變多波長檢測器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測器photo－diode－arraydetector（PDAD，PDA,DAD）：鎢燈和氘燈組合光源，進入檢測池的不是單色光，而是一段紫外波長上的光。PDA可以輔助定性。第31頁,共74頁，星期六，2024年，5月DAD檢測器3D圖第32頁,共74頁，星期六，2024年，5月示差折光檢測器（refractiveindexdetectorRID）：溶液的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質的折射率與其各自的摩爾分數(shù)的乘積之和。RID是通用型的檢測器，但是靈敏度不高。RID不能用于梯度洗脫。第33頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202434蒸發(fā)光散射檢測器第34頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202435安培檢測器電導檢測器庫侖檢測器介電常數(shù)檢測器極譜檢測器電學和電化學檢測器：第35頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202436完成數(shù)據(jù)采集和對儀器的控制。工作站：第36頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202437超高效液相色譜儀（UPLC）超高效液相色譜是分離科學中的一個全新類別，它給實驗室?guī)砹诵缕娑鴱姶蟮哪芰?。UPLC?借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。第37頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202438高效液相色譜法在藥典中的應用項目2000版2005版含量測定109527第38頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202439HPLC與TLC比較(2005版)含量測定TLC-SCHPLC藥材和提取物15175中成藥35352第39頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202440HPLC在中藥質量分析和檢測中的應用有效成分、指標成分的檢測；雜質或有關物質檢查；添加物或有害殘留物質的檢測；中藥指紋譜分析第40頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202441有效成分、指標成分的檢測

人參皂苷的檢測第41頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202442Flavones,Flavanones,andFlavanoneGlycosides

PeakIdentification

1.

Naringin

2.

Neohesperidin

3.

Myricetin

4.

Quercetin

5.

Naringenin

6.

KaempferolColumn:AlltimaC18,3μm,100x4.6mm

MobilePhase:A:50mMPotassiumPhosphate,pH2.5B:ACN

Gradient:(Time,%B)(0,20)(15,40)

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat280nm

第42頁,共74頁，星期六，2024年，5月Ginkgolides

PeakIdentification

1.

GinkgolideJ

2.

GinkgolideC

3.

GinkgolideA

4.

GinkgolideB

Column:NucleosilC18,5μm,250x2.1mm

PartNo.C-6000B

MobilePhase:Water:Methanol:Tetrahydrofuran(70:20:10)

FlowRate:0.2mL/min

Detector:500ELSD

第43頁,共74頁，星期六，2024年，5月雜質或有關

物質檢查第44頁,共74頁，星期六，2024年，5月添加物或有害殘留物質的檢測

OrganophosphatePesticides

PeakIdentification

1.

MethylParathion

2.

Dichlorvos

3.

Ethoprophos

4.

Azinphos

Column:AlltimaHPEPSC18,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(40:60)methanol:water

FlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat214nm

第45頁,共74頁，星期六，2024年，5月添加物或有害殘留物質的檢測

AflatoxinStandards

PeakIdentification

1.

AflatoxinG2

(0.06μg/mL)

2.

AflatoxinG1

(0.20μg/mL)

3.

AflatoxinB2

(0.06μg/mL)

4.

AflatoxinB1

(0.20μg/mL)

Column:InertsilODS-3V,5μ,150x4.6mm

MobilePhase:(50:50)Methanol:WaterFlowRate:1.0mL/min

Detector:UVat365第46頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202447中藥指紋譜分析第47頁,共74頁，星期六，2024年，5月第48頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.2024492005版HPLC方法應用有效成分\特征成分含量測定多成分指標含量測定多種檢測器應用第49頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202450有效成分\特征成分含量測定第50頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202451有效成分\特征成分含量測定第51頁,共74頁，星期六，2024年，5月多成分指標含量測定第52頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202453ELSD檢測方法應用第53頁,共74頁，星期六，2024年，5月銀杏葉提取物中銀杏酸的限量檢查第54頁,共74頁，星期六，2024年，5月含量樣品以總酸計ppm以銀杏酸13：0計ppm樣品10.40.4樣品20.20.2樣品30.40.4樣品43.83.8樣品52728樣品616671662樣品7524522樣品823392333樣品9392390樣品10316315第55頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202456

高效液相色譜法附錄修訂內容(2005版)

修訂內容和特點：明確了HPLC方法的幾種分離機制，為分類應用提供了基礎；明確了數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（色譜工作站）作為色譜信號記錄;以較大篇幅增加了色譜柱、檢測器、流動相的內容，適應快速發(fā)展的、日趨成熟的HPLC技術的要求。第56頁,共74頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。

高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內，各成分在柱內被分離，并依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。高效液相色譜法的主要分離機制有吸附、分配、離子交換和排阻作用。 2000版2005版第57頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202458對儀器的一般要求(2000版)所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填充劑和流動相的組分應按各品種項下的規(guī)定。常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學鍵合硅膠，后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。離子交換填充劑，用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等填充劑，用于分子排阻色譜等。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。在用紫外吸收檢測器時，所用流動相應符合紫外分光光度法(附錄ⅤA)項下對溶劑的要求。第58頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202459對儀器的一般要求(2005版)

1

所用的儀器為高效液相色譜儀。儀器應定期檢定并符合有關規(guī)定。（1）色譜柱最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統(tǒng)使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用。正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換填充劑用于離子交換色譜；凝膠或高分子多孔微球等填充劑用于分子排阻色譜等；手性鍵合填充劑用于對映異構體的拆分分析。第59頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202460對儀器的一般要求(2005版)

2

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果?？讖皆?50?以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物則應選擇孔徑在300?以上的填料。第60頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202461對儀器的一般要求(2005版)3

以硅膠為載體的一般鍵合固定相填充劑適用pH2～8的流動相。當pH大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH小于2時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用pH大于8的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH小于2的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機-無機雜化填充劑等。第61頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202462對儀器的一般要求(2005版)4(2)檢測器最常用的檢測器為紫外吸收檢測器，其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器（DAD）、熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。紫外、二極管陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測物的質量有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應；蒸發(fā)光散射檢測器屬質量型檢測器，對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規(guī)定波長范圍內的吸收光譜，故可用于待測物的光譜測定和色譜峰純度的檢查。

第62頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202463對儀器的一般要求(2005版)5紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與待測物的質量在一定范圍內呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與待測物的質量通常并不呈線性關系，必要時需對響應值進行數(shù)學轉換后進行計算。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應至少符合紫外-可見分光光度法（附錄ⅣA）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。第63頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202464對儀器的一般要求(2005版)5

（3）流動相由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常不應低于5％，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。

第64頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202465梯度洗脫

按設定的時間程序改變流動相系統(tǒng)溶劑組成的比例的洗脫方法.

例:“以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按下表進行梯度洗脫”(人參)第65頁,共74頁，星期六，2024年，5月第66頁,共74頁，星期六，2024年，5月03.06.202467梯度洗脫以有機溶劑相作為流動相A，以水相（含酸、鹽等）為流動相B；使用混合流動相的，以含有機相比例較高的為流動相A，含水比例高的為流動相B。第67頁,共74頁，星期六，2024年，5月正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內記錄完畢。

正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定適用牌號的填充劑方能滿足分離要求者，可在該品種項下注明。第68頁,共74頁，星期六，2024年，5月按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復性和拖尾因子。

色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括分離度、理論板數(shù)、重復性和拖尾因子等四個指標。其中，分離度和重復性是系統(tǒng)適用性試驗中更