SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量

實驗SDS測定蛋白質(zhì)

相對分子質(zhì)量

電泳（electrophoresis）是指帶電顆粒在電場中的泳動。許多生物分子如氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等都含有可電離基團，在非等電點條件下帶有電荷，在電場力的作用下，它們向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳技術(shù)就是利用樣品中各種分子帶電性質(zhì)、分子大小、形狀等的差異，在電場中的遷移速度不同，從而對樣品進行分離、純化和鑒定的一種綜合技術(shù)。可用于樣品的制備、純度鑒定、分子量測定等。影響帶電粒子在電場中泳動的因素1．生物大分子的性質(zhì)：待分離生物大分子所帶電荷的多少、分子大小和性質(zhì)都會對電泳產(chǎn)生明顯影響。2．緩沖液：緩沖液pH值直接影響生物大分子的解離程度和帶電性質(zhì)。溶液pH值距離等電點愈遠(yuǎn)，生物大分子所帶凈電荷就越多，電泳時速度就越快。當(dāng)緩沖液pH大于等電點時，生物大分子帶負(fù)電荷，電泳時向正極移動；當(dāng)緩沖液pH小于等電點時，生物大分子帶正電荷，電泳時向負(fù)極移動。3．電場強度：電場強度指每單位介質(zhì)長度的電位梯度（又稱電位差或電位降）。一般而言，電場強度越大，電泳速度越快。但隨著電場強度的增大會引起通過介質(zhì)的電流強度增大，從而造成電泳過程產(chǎn)生的熱量增多，最終導(dǎo)致介質(zhì)溫度升高。降低電流強度，可以減少產(chǎn)熱，但會延長電泳時間，引起生物大分子擴散增加，同樣影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當(dāng)?shù)碾妶鰪姸取?．電滲：液體在電場中對于固體支持介質(zhì)的相對移動稱為電滲。由于支持介質(zhì)表面存在一些帶電基團，如濾紙表面含有羧基，瓊脂含有硫酸基等。這些基團使支持介質(zhì)表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子在電場作用下向電極方向移動，形成介質(zhì)表面溶液的流動。當(dāng)電滲方向與電泳方向相同時則加快電泳速度；當(dāng)電滲方向與電泳方向相反時，則降低電泳速度。5．支持介質(zhì)的篩孔：支持介質(zhì)的篩孔大小對生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質(zhì)中泳動速度快，反之則泳動速度慢。電泳技術(shù)的分類1．根據(jù)電泳中是否使用支持介質(zhì)分為自由電泳和區(qū)帶電泳：①自由電泳不使用支持介質(zhì)，電泳在溶液中進行。②區(qū)帶電泳需使用支持介質(zhì)，根據(jù)支持介質(zhì)不同可分為醋酸纖維薄膜電泳、薄層電泳和凝膠電泳等。根據(jù)支持介質(zhì)的裝置形式不同又可分為水平板式電泳、垂直板式電泳、垂直盤狀電泳、毛細(xì)管電脈等。2．根據(jù)電泳時電壓的高低分為高壓電泳和常壓電泳：①高壓電泳使用的電壓在500～1000V，這類電泳分離速度快，但熱效應(yīng)較大，必須具備冷卻裝置，主要適用于小分子化合物的快速分離。②常壓電泳使用的電壓在500V以下，電位梯度為2～10V/cm。這類電泳的分離速度較慢，但對電泳設(shè)備要求簡單。3．根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)分為連續(xù)pＨ電泳和不連續(xù)pＨ電泳：①連續(xù)pH電泳是指電泳全過程中pH保持不變。②不連續(xù)pH電泳是指電極緩沖液和電泳支持介質(zhì)中的pH不同，甚至電泳支持介質(zhì)不同區(qū)段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝膠電泳。4．根據(jù)工作目的和分離樣品的數(shù)量多少分為分析電泳和制備電泳。

5．根據(jù)結(jié)合配套的技術(shù)種類不同分為免疫電泳、層析電泳、等電聚焦電泳、轉(zhuǎn)移電泳、雙相電泳、脈沖梯度電場凝膠電泳和相互垂直交替電場凝膠電泳等。6．根據(jù)電泳物質(zhì)類別不同分為細(xì)胞電泳、核酸電泳、蛋白質(zhì)電泳等。丙烯酰胺凝膠電泳：以聚丙烯酰胺凝膠為支持物的電泳方法稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，具有機械強度好、彈性大、透明、化學(xué)穩(wěn)定性高、無電滲作用、設(shè)備簡單、樣品量小（1～100μg）、分辨率高等優(yōu)點，并可通過控制單體濃度或與交聯(lián)劑的比例聚合成不同大小孔徑的凝膠。可用于蛋白質(zhì)、核酸等分子大小不同的物質(zhì)的分離、定性和定量分析。聚丙烯酰胺凝膠：是由丙烯酰胺（Acr）與交聯(lián)劑甲撐雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下，經(jīng)過聚合交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚丙烯酰胺凝膠的聚合體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：通常采用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在TEMED催化下，過硫酸銨可使丙烯酰胺單體的雙鍵打開、活化形成自由基丙烯酰胺，從而引發(fā)聚合作用。（2）光聚合：通常采用核黃素作催化劑，核黃素在光照下光解成無色基，后者再被氧化成自由基而引發(fā)聚合作用。光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定。化學(xué)聚合的凝膠孔徑較小，且各次制備的重復(fù)性好。故一般采用化學(xué)聚合。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。濃縮效應(yīng)在濃縮膠中進行；電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)在分離膠中進行。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決于它所帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。丙烯酰胺凝膠電泳還可結(jié)合十二烷基硫酸鈉（SDS）以測定蛋白質(zhì)亞基的相對分子質(zhì)量。SDS是一種陰離子型去污劑，在蛋白質(zhì)溶解液中加入SDS和巰基乙醇后，巰基乙醇可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原；SDS能使蛋白質(zhì)的非共價鍵（氫鍵、疏水鍵）打開，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，形成蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物。由于SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負(fù)電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差異。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還引起了蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙形的長橢圓棒。不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣，而長軸則隨蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的大小成正比地變化。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只是橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的函數(shù)?！静僮鞑襟E】一、安裝垂直板型電泳裝置查漏二、凝膠的制備

分離膠的制備在一個干凈的小燒杯中，按所列的試劑用量配制。

SDS-不連續(xù)系統(tǒng)12％分離膠濃度，10ml體積配制量：1.30%凝膠貯液4.0ml2.分離膠緩沖液1.25ml3.10%SDS0.1ml4.ddH2O4.0ml5.10%過硫酸胺0.07ml（冬天）（0.05ml）6.2%TEMED0.6ml濃縮膠的制備在另一個干凈的小燒杯中。

4.5％分離膠濃度，5ml體積配制用量表：1.30%凝膠貯液0.75mL2.濃縮膠緩沖液0.83mL3.10%SDS

0.1ml4.ddH2O3.0mL10%過硫酸胺0.05mL（冬天）（0.03mL）

2%TEMED

0.3mL樣品10μL樣品15μL蛋白marker15μL樣品15μL樣品10μL兩塊膠一個電泳系統(tǒng)，兩組共用：第一塊膠第一組加樣第二組加樣牛血清15μL樣品15μL蛋白marker15μL樣品15μL牛血清15μL兩塊膠一個電泳系統(tǒng)，兩組共用：第二塊膠第一組加樣第二組加樣三加樣將pH8.3的電極緩沖溶液倒入上、下貯槽中，應(yīng)沒過短玻璃片。用微量注射器依次在各個樣品凹槽內(nèi)加樣，一般加樣體積為10～15μL。如樣品較稀，可加20～30μL。由于樣品溶解液中含有比重較大的甘油，故樣品溶液會自動沉降在凝膠表面形成樣品層。四電泳將上槽接負(fù)極，下槽接正極。打開電源，開始時將電壓恒壓60V，待樣品進入分離膠后，120V。藍色染料遷移至下端約1～1.5cm時，停止電泳，約需1～2小時。

五剝膠取下凝膠模子，將凝膠片取出，滑入一白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)。六染色和脫色

染色用一塊膠，另一塊膠用于轉(zhuǎn)膜。加入染色液，染色45分鐘。脫色

染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。20～30min換一次脫色液，2～3次后可初步觀察電泳條帶，然后脫色過夜，直至背景清晰。七Mr的計算通常以相對遷移率(mr)來表示遷移率。相對遷移率的計算方法如下：相對遷移率(mr)=樣品遷移距離(cm)／染料遷移距離(cm)。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)(縱坐標(biāo))對相對遷移率(橫坐標(biāo))作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣品的相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相對分子質(zhì)量八轉(zhuǎn)膜膠放在3張緩沖液浸濕的濾紙上，蓋上經(jīng)甲醇激活（15-30sec）的PVDF膜（切多余的膜及紙，與凝膠一樣大?。┡艢馀荩w同樣3張緩沖液浸濕的濾紙，排氣泡。順序：