食品安全的快速檢測(cè)-食品微生物快速檢測(cè)

阪崎腸桿菌熒光PCR檢測(cè)阪崎腸桿菌的介紹一熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的介紹二阪崎腸桿菌熒光PCR檢測(cè)三目錄介紹阪崎腸桿菌阪崎腸桿菌是寄生在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性菌，屬腸桿菌科腸桿菌屬，周生鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，以前一直被稱為“陰溝腸桿菌”?；谒c陰溝腸桿菌在生化反應(yīng)、色素產(chǎn)物和抗菌靈敏度上存在差異，所以于1980年更名為阪崎腸桿菌。

阪崎腸桿菌可導(dǎo)致嬰兒及早產(chǎn)兒腦膜炎、敗血癥和壞死性結(jié)腸炎，死亡率高達(dá)50％，已引起世界多國(guó)相關(guān)部門的重視。國(guó)家食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)自2007年起把阪崎腸桿菌列為嬰兒配方食品重點(diǎn)監(jiān)測(cè)病原菌。

介紹阪崎腸桿菌

阪崎腸桿菌具有產(chǎn)生a-葡萄糖苷酶和吐溫80脂酶、不發(fā)酵三梨醇以及無(wú)磷酸胺酶活性等生理生化特征，并且對(duì)干燥、滲透壓和抗生素等有很強(qiáng)的抗性。該菌自然來(lái)源非常廣泛，在水、土壤、植物根莖、動(dòng)物腸道甚至加工食品中都可存在。

介紹PCR檢測(cè)技術(shù)基于a-葡萄糖苷酶反應(yīng)的特異性生化檢測(cè)和PCR擴(kuò)增的分子檢測(cè)技術(shù)已取得重要進(jìn)展，但是目前還缺乏一種穩(wěn)定檢測(cè)該菌的分子分型檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)，被公認(rèn)為診斷標(biāo)準(zhǔn)的新型實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增熒光檢測(cè)技術(shù)和儀器實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀可以實(shí)現(xiàn)阪崎腸桿菌的分子分型定量檢測(cè)。PCR檢測(cè)法的分類及優(yōu)點(diǎn)PCR檢測(cè)技術(shù)熒光法電泳法ELISA法靈敏度高特異性強(qiáng)抗污染能力強(qiáng)容易操作PCR技術(shù)的發(fā)展熒光PCR法PCR的發(fā)展可分為3階段：定性PCR（電泳法）酶免法定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)熒光PCR法重復(fù)性、穩(wěn)定性好濃度梯度試驗(yàn)線性范圍寬熱循環(huán)熱降溫快速熒光定量在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析標(biāo)本取樣阪崎腸桿菌熒光PCR檢測(cè)法取樣前消毒樣品包裝的開啟處和取樣工具。按照“三管”增菌法，無(wú)菌稱取100g、10g和1g樣品各三份分別加入2L、250mL、125mL的樣品稀釋瓶中，加入9倍預(yù)熱到45℃的滅菌水（1:10稀釋），或者將樣品直接稱量到裝有9倍預(yù)熱的45℃滅菌水的樣品稀釋瓶中振蕩使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18~22h分別移取培養(yǎng)18~22h的懸液各10mL加入90mL腸桿菌增菌肉湯（EE肉湯）中，36℃±1℃培養(yǎng)18~22h檢測(cè)步驟（1）試劑制備取出反應(yīng)管N支（N=樣本數(shù)＋1管陽(yáng)性對(duì)照＋1管陰性對(duì)照），快速離心后，存于4℃?zhèn)溆?。?）DNA提取標(biāo)本處理：每瓶培養(yǎng)的EE肉湯分別取1mL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，8000r/min離心5min，盡量吸取去除上清液；加入50μLDNA提取液（使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸?。靹蚝蠓兴?0min,12000r/min離心5min，取上清液2μL做模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。（3）PCR擴(kuò)增取出備用的PCR反應(yīng)管，分別加入處理后的樣品上清2μL，陰陽(yáng)性對(duì)照直接加2μL,瞬時(shí)離心后放人儀器樣品槽進(jìn)行PCR反應(yīng)。食品快速檢測(cè)技術(shù)分類試驗(yàn)有效性判定設(shè)定閾值線高于陰性對(duì)照最高點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值≤25.0，反應(yīng)有效。食品快速檢測(cè)技術(shù)分類結(jié)果判定食品快速檢測(cè)技術(shù)分類設(shè)定閾值線高于陰性對(duì)照最高點(diǎn)，檢驗(yàn)樣本Ct值小于或等于25.0時(shí)，報(bào)告阪崎腸桿菌篩選陽(yáng)性；檢驗(yàn)樣本Ct值大于25.0且小于30.0時(shí)，重復(fù)一次，如果Ct值仍小于30.0,且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，可報(bào)告阪崎腸桿菌篩選陽(yáng)性，否則報(bào)告阪崎腸桿菌未檢出；樣本檢驗(yàn)不到Ct值，或Ct值為0時(shí)，報(bào)告阪崎腸桿菌未檢出。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌介紹一金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法二金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)三目錄介紹金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)也稱“金葡菌”，隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽(yáng)性菌代表，為一種常見的食源性致病微生物。該菌最適宜生長(zhǎng)溫度為37℃，pH為7.4，耐高鹽，可在鹽濃度接近10%的環(huán)境中生長(zhǎng)。金黃色葡萄球菌常寄生于人和動(dòng)物的皮膚、鼻腔、咽喉、腸胃、癰、化膿瘡口中，空氣、污水等環(huán)境中也無(wú)處不在。

介紹金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生多種致病性物質(zhì)，如腸毒素及凝固酶等。金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題，據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，居第2位，占細(xì)菌性食物中毒的33％，加拿大的發(fā)生率更高，占細(xì)菌性食物中毒的45％。限量標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌

我國(guó)每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)于2013年發(fā)布《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》(GB29921-2013)，在國(guó)標(biāo)中制定了金黃色葡萄球菌的限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定熟肉制品、熟制水產(chǎn)品、熟制糧食制品等8大類食品中，同批次采集5份樣品，每份樣品中的金黃色葡萄球菌濃度均不得超出1000CFU/g，僅允許其中1份樣品在100~1000CFU/g之間。檢測(cè)方法金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法目前，金葡菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)生化鑒定方法、免疫學(xué)、分子生物學(xué)快速檢測(cè)方法等。傳統(tǒng)生化鑒定方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性強(qiáng)，成本低，是目前最常用的鑒定方法。方法金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法免疫學(xué)檢測(cè)方法主要是基于免疫學(xué)理論研究，其是通過(guò)設(shè)計(jì)的抗原、抗體和免疫細(xì)胞，檢測(cè)抗原和抗體的結(jié)合以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的，從而達(dá)到檢測(cè)目的一種實(shí)驗(yàn)方法。該技術(shù)方法主要包括酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法、免疫膠體金法等

方法金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法方法金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR）技術(shù)，核酸探針技術(shù)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等技術(shù)。方法金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法試劑盒法：試劑盒法通常將十多種，甚至幾十種培養(yǎng)基或成分集中在特定微型裝置內(nèi)，通過(guò)觀察微生物的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程的某些產(chǎn)物或現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)現(xiàn)象進(jìn)行分析，將傳統(tǒng)試驗(yàn)中多次試驗(yàn)通過(guò)一次完成，縮短了檢測(cè)時(shí)間。此法可大大縮短測(cè)試時(shí)間，在24h內(nèi)得出結(jié)果，甚至某些可縮短至4h內(nèi)。目前，用于檢測(cè)金黃色葡萄球菌的成品試劑盒有API、MIS等

測(cè)試片的原理金黃色葡萄球菌測(cè)試片本試驗(yàn)利用金黃色葡萄球菌自身生化特性優(yōu)化培養(yǎng)基，通過(guò)代謝而產(chǎn)生特異性酶或其他特異性物質(zhì)，在培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的顯色底物，使菌落呈現(xiàn)特定的顏色實(shí)現(xiàn)分離和鑒別。通過(guò)無(wú)紡布、冷凝膠、塑料薄膜等作為培養(yǎng)基的載體，將以上材料組裝成金黃色葡萄球菌的測(cè)試片，縮短了檢測(cè)時(shí)間、降低了勞動(dòng)強(qiáng)度、節(jié)約成本。檢測(cè)原理金黃色葡萄球菌測(cè)試片金黃色葡萄球菌測(cè)試片（FilmplateTMStaphylococcusaureusBT206)含有選擇性培養(yǎng)基和專一性的酶顯色劑，運(yùn)用微生物測(cè)試片專有技術(shù)，做成一次性快速檢驗(yàn)產(chǎn)品，一步培養(yǎng)15~24h就可確認(rèn)是否有病原菌的存在，大大地簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序。金黃色葡萄球菌測(cè)試片適用范圍金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)本產(chǎn)品適用于各類生、熟食制品，飲料，糕點(diǎn)類，調(diào)味品，乳制品等的快速檢測(cè)。樣品處理金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)取樣品25mL(g)放入含有225mL滅菌磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的取樣罐或均質(zhì)杯內(nèi)，制成1:10的樣品勻液，調(diào)節(jié)樣品勻液pH至6.0~8.0。用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL稀釋液的試管內(nèi)，振搖后成為1:100的樣品勻液，以此類推，每次換一支吸管。接種一般食品選2~3個(gè)稀釋度進(jìn)行檢測(cè)，將金黃色葡萄球菌測(cè)試片（BT206)置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，揭開上層膜，用無(wú)菌吸管吸取1mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然后再將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右，使培養(yǎng)基凝固，每個(gè)稀釋度接種兩片。做一片空白陰性對(duì)照。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)培養(yǎng)將測(cè)試片疊在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過(guò)12片。培養(yǎng)溫度為36℃±1℃,培養(yǎng)15~24h。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)培養(yǎng)后測(cè)試片現(xiàn)象測(cè)試片上紫紅色的菌落為金黃色葡萄球菌；呈藍(lán)色的菌落為其他大腸菌群。

出現(xiàn)陽(yáng)性菌落的樣本，最好用其他更為可靠的方法進(jìn)行驗(yàn)證，沒有條件的至少要再取樣重復(fù)檢驗(yàn)一次。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)結(jié)果判讀（1）選擇菌落數(shù)在20~200個(gè)之間的紙片進(jìn)行計(jì)數(shù)。（2）若兩個(gè)稀釋度的菌落數(shù)均在20~200之間，則取其平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，即為每毫升（或每克）樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。（3）如果所有稀釋度的測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于20,則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之；如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告之。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)結(jié)果判讀

（4）如果所有稀釋度的菌落數(shù)都大于200，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。計(jì)數(shù)菌落數(shù)大于200的測(cè)試片時(shí)，也可計(jì)數(shù)一個(gè)或兩個(gè)具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20(濾紙區(qū)面積為20cm2)，即為測(cè)試片上估算的菌落數(shù)。報(bào)告單位以CFU/mL(或CFU/g)表示。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)省去了配制培養(yǎng)基、分裝滅菌等前處理和試驗(yàn)后清洗玻璃器皿等一系列繁雜的準(zhǔn)備和整理工作，能大幅度減少工作量；攜帶方便，檢測(cè)成本較低；操作簡(jiǎn)便迅速，對(duì)操作人員和檢驗(yàn)設(shè)備及場(chǎng)所的要求也不高，可在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或食品生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行推廣應(yīng)用。金黃色葡萄球菌的快速檢測(cè)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）檢測(cè)背景01實(shí)驗(yàn)方法及原理02樣品處理與測(cè)定步驟03應(yīng)用范圍及結(jié)果分析04檢測(cè)背景檢測(cè)背景沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌。沙門氏菌病是指由各種類型沙門氏菌所引起的對(duì)人類、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱。感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。：）沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）@_@實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)方法及原理酶聯(lián)免疫吸附法01該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確地將有害微生物檢測(cè)出來(lái)。沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)試劑02固相的抗原或抗體1酶標(biāo)抗體或抗原2顯色劑3沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）實(shí)驗(yàn)方法及原理實(shí)驗(yàn)原理03@_@沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）樣品處理與測(cè)定步驟樣品處理與測(cè)定步驟樣品處理01待測(cè)樣品勻液的制備與稀釋:)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）樣品處理與測(cè)定步驟測(cè)定步驟02加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1mL,37℃孵育0.5～1h,洗滌。2:)加一定稀釋的待測(cè)樣品0.1mL于已包被異性抗體反應(yīng)孔中，置37℃孵育1h，然后洗滌，同時(shí)做空白孔、陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照孔。1:)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中，加入臨時(shí)配制的底物溶液0.1mL,37℃孵育10～30min。3:)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）樣品處理與測(cè)定步驟測(cè)定步驟02結(jié)果測(cè)定置于酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔的OD值，并記錄結(jié)果，讀數(shù)在加終止液10min內(nèi)完成。5:)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。4:)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）樣品處理與測(cè)定步驟測(cè)定步驟02@_@沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）適用范圍及結(jié)果分析適用范圍及結(jié)果分析應(yīng)用范圍01所有食品原料中的沙門氏菌檢測(cè):)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）適用范圍及結(jié)果分析結(jié)果分析02臨界值(CO，cutoff)的計(jì)算:臨界值=陰性對(duì)照孔OD均值×2.1。1:)沙門氏菌的快速檢測(cè)（酶聯(lián)免疫吸附法）陰性對(duì)照孔OD(opticaldensity)均值大于0.1時(shí)重新實(shí)驗(yàn)，小于0.05時(shí)以0.05計(jì)