基因工程賦予生物新的遺傳特性高二下學(xué)期生物浙科版選擇性必修三

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法冠癭病農(nóng)桿菌冠癭病與農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞接觸T-DNA區(qū)段的釋放及轉(zhuǎn)移T-DNA區(qū)段入核及表達(dá)農(nóng)桿菌侵染植物改造后的工程Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒在基因工程中的應(yīng)用實驗過程討論為什么不使用天然的Ti質(zhì)粒？相比于基因槍法、電擊法等轉(zhuǎn)化方法，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點有哪些？③缺少標(biāo)記基因①含有導(dǎo)致植物患冠癭病的基因②沒有方便目的基因插入的集中的酶切位點①成功率高，效果好②機(jī)理研究清楚，方法成熟，應(yīng)用廣泛③遺傳穩(wěn)定性好④操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡單，易于推廣課時總結(jié)農(nóng)桿菌感染植物后，可自發(fā)地遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞農(nóng)桿菌不進(jìn)入植物細(xì)胞，僅有T-DNA區(qū)段進(jìn)入植物細(xì)胞T-DNA區(qū)段進(jìn)入受體細(xì)胞后，會整合到受體細(xì)胞的核基因組中并進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì)，為了改善黃瓜的品質(zhì)，科學(xué)家利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將一種甜蛋白基因成功導(dǎo)入黃瓜細(xì)胞，得到了轉(zhuǎn)基因植株。下圖1、圖2分別為甜蛋白基因編碼鏈（僅示部分堿基）和Ti質(zhì)粒的示意圖，其中①～⑤表示不同位點。請回答問題：(1)科研人員對載體Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造時，需要插入多個限制酶單一切點，應(yīng)選擇在圖2中的位點_________（填序號）處插入。T-DNA的作用是將甜蛋白基因?qū)朦S瓜細(xì)胞并_________________________________。(2)將上述融合基因插入圖乙所示Ti質(zhì)粒的T-DNA中，構(gòu)建_________并導(dǎo)入________中。將其接種在含____________的培養(yǎng)基上，再利用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，可以得到用于轉(zhuǎn)化的侵染液。(3)剪取黃瓜的葉片放入侵染液中一段時間，此過程的目的是_____________________，后再轉(zhuǎn)化黃瓜細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后應(yīng)在培養(yǎng)基中添加_________，篩選轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織。③整合到黃瓜細(xì)胞的染色體DNA上表達(dá)載體農(nóng)桿菌卡那霉素利用農(nóng)桿菌將融合基因?qū)胗筒思?xì)胞潮霉素微生物的藍(lán)白斑實驗一、實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)藍(lán)白斑篩選重組菌落的原理及方法。二、實驗器材：1、材料：受體菌JM109（需在-80℃保存，或在干冰中短時間保存），pMD19-T載體試劑盒、ITPG溶液、X-Gal、NaCl、瓊脂、酵母粉、蛋白胨、冰、燒杯、錐形瓶、玻璃棒、移液器、離心管、培養(yǎng)皿等。2、儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、離心機(jī)、攪拌器、冰箱等。

三、實驗原理：

藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的細(xì)菌重組子的篩選方法。野生型埃希氏大腸菌（E.Coli）產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。5-溴-4-靛藍(lán)可使整個菌落產(chǎn)生藍(lán)色變化。在經(jīng)人工插入外源基因后，突變型大腸桿菌的β半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切斷，無法形成完整的β半乳糖苷酶，故不能對無色化合物X-gal進(jìn)行切割，菌落呈白色。

在指示培養(yǎng)基上，重組質(zhì)粒的菌落是白色的，非重組質(zhì)粒的菌落是藍(lán)色的，以顏色不同為依據(jù)直接篩選重組克隆的方法。重組質(zhì)粒：外源基因插入后，LacZ基因被破壞，不能產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物。實驗中，通常藍(lán)白篩選是與抗性篩選同時使用的。含X-Gal的培養(yǎng)基同時含有一種或多種載體所攜帶抗性相對應(yīng)的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：（1）未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長；（2）轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長成藍(lán)色菌落；（3）轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長成白色菌落。

四、實驗步驟：1、將ITPG和X-Gal配制為溶液，除菌后冷凍保存，備用。2、制備LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、含氨芐青霉素（標(biāo)記為Amp+）的LB固體培養(yǎng)基，備用。3、重組質(zhì)粒的制備4、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌5、制備含ITPG、X-Gal的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)制）：取適量ITPG、X-Gal溶液均勻涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，晾干。6、涂板：取100μL步驟4獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)菌分別涂布于添加IPTG、X-Gal的培養(yǎng)基表面，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12h。7、觀察：實驗組和對照組經(jīng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌落呈現(xiàn)出不同的顏色，分別統(tǒng)計實驗組、對照組中的藍(lán)斑和白斑數(shù)目。

四、實驗步驟：

五、大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)點：1、積累了充足經(jīng)驗，有非常多的載體可供應(yīng)用；2、可以因不同載體而選擇不同菌種做宿主；3、操作安全，致病能力低；4、菌種取材方便，成本相對比較低；1.【2019年4月選考】通常從腐爛的水果上分離產(chǎn)果膠酶的微生物，其原因除水果中果膠含量較高外，還有______________________________________________________________。腐爛的水果中含產(chǎn)果膠酶的微生物較多油田淤泥中富含咔唑，能聚集降解咔唑的菌株2.【杭二中開學(xué)檢測】咔唑是一種含氮有機(jī)物，對生物具有毒性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，釋放單環(huán)境中后難以被降解?？蒲腥藛T從油田淤泥中分離篩選出降解咔唑的高效菌株。本實驗選擇從油田淤泥中分離降解咔唑的高效菌株的原因可能是_________________________________________________。3.科研人員從鹽堿土壤中分離得到芽孢桿菌B3菌株，檢測表明，

該菌株能分泌抗菌肽，對大腸桿菌、沙門氏菌等具有抑菌作用，該抗菌肽生產(chǎn)的基本流程如下：制備土壤懸液制備培養(yǎng)基液體

發(fā)酵制備抗菌肽粗提物分離提純抗菌肽抑菌效果檢測抑菌效果檢測：①在培養(yǎng)基尚末凝固時加入適量的大腸桿菌菌液，制成試驗平板備用；②制備無菌濾紙小圓片，浸泡于經(jīng)______滅菌的抗菌肽溶液；③取出小紙片置于試驗平板中培養(yǎng)一段時間后測定___________________的大小，判定抑菌效果。試驗進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，小紙片周圍的細(xì)菌出現(xiàn)破裂、內(nèi)容物流出的情況，說明抗菌肽會導(dǎo)致細(xì)菌_____________結(jié)構(gòu)被破損。由于抗菌肽對真核細(xì)胞無毒性，可將其代替_________使用于動