細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭染色實(shí)驗(yàn)報(bào)告

實(shí)驗(yàn)二：細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握細(xì)菌涂片的制備方法。2.掌握細(xì)菌簡(jiǎn)單染色和革蘭染色法的原理及操作步驟，識(shí)別細(xì)菌的革蘭染色結(jié)果。3.鞏固顯微鏡油鏡的使用方法。4.學(xué)習(xí)無菌操作技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理1、染色原理：細(xì)菌生長(zhǎng)于酸性、中性和堿性溶液時(shí)常帶負(fù)電荷，所以通常采用帶正電荷的堿性染料（如美藍(lán)、甲紫、堿性復(fù)紅或孔雀綠等）使其著色。當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加易被帶負(fù)電的酸性染料（如伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅）著色。2、革蘭染色法原理：革蘭染色法可根據(jù)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同，將其分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。革蘭陽性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭陰性細(xì)菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部份細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物洗去而被脫色。另外，革蘭染色的差異并不能完全認(rèn)為是化學(xué)的差別，也有物理結(jié)構(gòu)不同的結(jié)果。如酵母菌細(xì)胞壁的成份完全與細(xì)菌不同，但具有革蘭染色陽性反應(yīng)。

三、實(shí)驗(yàn)儀器，材料和用具1、儀器及用具：顯微鏡、酒精燈、火柴、接種環(huán)、載玻片、蓋玻片、鑷子、擦鏡紙、鏡油、無菌牙簽2、菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、試劑：結(jié)晶紫染液、革氏碘液、洗脫液（95%乙醇溶液）、番紅染液四、實(shí)驗(yàn)步驟（1）簡(jiǎn)單染色1、載玻片的處理：用紗布將取出的載玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷卻待用。2、涂片：左手持菌液試管，右手持接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌，待接種環(huán)冷卻后在火焰旁從試管中取一環(huán)菌液，在潔凈無脂的載玻片上涂一直徑約2mm的均勻薄膜。3、干燥：涂片后待其自然干燥。4、固定：將以干燥好的涂片標(biāo)本朝上，在酒精燈火焰上通過2~3次，要求載玻片溫度不能超過60度，以手背觸載片不燙為宜。5、染色：滴加一滴結(jié)晶紫染液，染色1min。6、水洗：用水將染液洗去，再用吸水紙將水吸干。7、鏡檢（2）革蘭染色1~4步與簡(jiǎn)單染色相同。5、初染：滴加一滴結(jié)晶紫染液，染色1min。而后水洗，吸干。6、媒染：加一滴碘液覆蓋涂片1min，水洗，吸干。7、脫色：滴加洗脫液，輕輕搖動(dòng)載玻片，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗，吸干。整個(gè)脫色過程約20~30秒。8、復(fù)染：滴加番紅染液復(fù)染3min，水洗，吸干。9、鏡檢：蓋上蓋玻片，從低倍鏡到油鏡依次觀察標(biāo)本。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（照片）菌種形態(tài)特征染色結(jié)果結(jié)論與理論是否相符金黃色葡萄球菌個(gè)體小、球狀、成團(tuán)存在紫色革蘭氏陽性相符枯草芽孢桿菌個(gè)體較大、桿狀、多成對(duì)存在紫色革蘭氏陽性相符未知菌S1個(gè)體較大、鏈狀桿菌、多成對(duì)存在紫色革蘭氏陽性-----牙垢多桿狀細(xì)菌有紫色，也有脫色的革蘭氏陽性和陰性菌都存在基本相符未知菌S3個(gè)體小、呈點(diǎn)狀脫色革蘭氏陰性------大腸桿菌桿狀、較小脫色革蘭氏陰性相符金黃色葡萄球菌（紫色）(a)金黃色葡萄球菌（100×10倍）金黃色葡萄球菌（紫色）(b)枯草芽孢桿菌（100×10倍）枯草芽孢桿菌（紫色）枯草芽孢桿菌（紫色）(c)未知菌S1(100×10倍)未知菌S1（顯微鏡下觀察為紫色，照出的結(jié)果有些失真）未知菌S1（顯微鏡下觀察為紫色，照出的結(jié)果有些失真）(d)牙垢（100×10倍）口腔上皮細(xì)胞牙垢中的桿菌（紫色）口腔上皮細(xì)胞牙垢中的桿菌（紫色）(e)未知菌S3（100×10倍）未知菌S3（理論上應(yīng)該是紅色，但結(jié)果是顏色全部脫掉了）未知菌S3（理論上應(yīng)該是紅色，但結(jié)果是顏色全部脫掉了）(f)大腸桿菌（100×10倍）大腸桿菌（理論上是紅色，但顯然番紅并沒有染上）大腸桿菌（理論上是紅色，但顯然番紅并沒有染上）六、實(shí)驗(yàn)討論1、影響微生物革蘭染色結(jié)果的因素：（1）菌齡：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌，結(jié)果更為典型（2）操作：熱固定：溫度不能太高，否則會(huì)造成細(xì)菌結(jié)構(gòu)的破壞。

染料量：應(yīng)過量，但也不需太多，以免浪費(fèi)。初染和媒染時(shí)間：在30~60sec為宜。

復(fù)染時(shí)間：可稍長(zhǎng)。脫色：20-30s，以流下的脫色液無色為準(zhǔn)。水洗：要充分。2、微生物革蘭染色注意事項(xiàng)：（1）取菌液不要貪多，會(huì)造成菌體堆積，染色效果不好。而且不容易干，浪費(fèi)時(shí)間，涂2mm左右大即可。（2）接種環(huán)冷卻后再取菌，避免加熱時(shí)間過長(zhǎng)，以免細(xì)菌破裂或變形。染色不上往往是固定溫度太高和加熱時(shí)間過長(zhǎng)造成的，固定溫度應(yīng)盡量低。（3）脫色時(shí)，滴加一兩滴洗脫液，搖搖倒掉，再滴加，再倒掉，直至倒掉的洗脫液無色，再迅速水洗。

（4）每一步水洗后都應(yīng)將水吸干，以免稀釋染液。（5）復(fù)染時(shí)要不斷地滴加染液（避免染液變干）使染色更充分。3、酵母菌能進(jìn)行染色嗎?結(jié)果如何?為什么?答：能。結(jié)果理論上應(yīng)是革蘭陽性。原因：酵母的細(xì)胞壁不含肽聚糖，主要成分是葡聚糖、甘露聚糖，還有幾丁質(zhì)等，它們都是多糖的復(fù)雜分支聚合物，不溶于乙醇。且酵母細(xì)胞壁脂類較少，因此在媒染后，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易脫出細(xì)胞壁，故呈現(xiàn)革蘭氏陽性反應(yīng)。

4、牙垢里大概能看到幾類菌，哪幾種較多？通過網(wǎng)上的資料可知，牙垢（又稱牙菌斑）是在牙齒表面逐漸沉積的生物薄膜，由食物殘?jiān)?、脫落的口腔上皮?xì)胞、唾液和細(xì)菌構(gòu)成。牙垢中的細(xì)菌主要是正?？谇粌?nèi)存在的鏈球菌、厭氧菌等。這些細(xì)胞應(yīng)大部分是革蘭氏陽性細(xì)菌,其原因也可大致理解為：口腔中的環(huán)境對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)而言還是比較苛刻的，因此能適應(yīng)這種環(huán)境的細(xì)菌表面的肽聚糖層應(yīng)較厚，故為革蘭氏陽性。我們組在實(shí)驗(yàn)中觀察到的牙垢中的細(xì)菌多數(shù)顏色還是比較深的，而且其中有許多紫色的小點(diǎn)（球狀菌），但照出來的結(jié)果有些失真（細(xì)菌的顏色變淺，被染成紫色的球狀菌也不見了），其原因我現(xiàn)在還沒有想清楚，還請(qǐng)助教和老師不吝賜教。另外，圖中大的呈透明或粉紅色的細(xì)胞是口腔上皮細(xì)胞，而不是細(xì)菌。5、對(duì)未知菌S3和大腸桿菌染色結(jié)果的反思從圖中可以看出，未知菌和大腸桿菌的染色效果都不理想。一方面可能是因?yàn)檫@兩種菌確實(shí)比較難染出好的效果。但我想，主要的原因應(yīng)該還是我們自己的操作有許多不當(dāng)之處。首先是用接種環(huán)取菌液前，冷卻的時(shí)間可能過短，致使接種環(huán)溫度較高，使所取細(xì)菌破裂。其次，可能是固定溫度不合適。因?yàn)槭堑谝淮巫鋈旧珜?shí)驗(yàn)，沒有經(jīng)驗(yàn)，不太清楚到底如何來控制固定溫度，因此只能不斷地去摸索和嘗試。很多時(shí)候，烤一次后用手背去感覺，溫度較低，便再烤一次，再用手背去感覺，便覺得燙了。所以，我覺得不能完全靠手背去感覺，還是應(yīng)該大概控制一下時(shí)間和距火焰的高度，這樣會(huì)比較穩(wěn)妥、精確。除此之外，致使染色效果不佳的另一個(gè)原因可能就是番紅染色的時(shí)間和染液用量控制的不好。開始幾次染色，我都是一次性的加完染液，然后靜等3min。后來聽到老師指點(diǎn)別的同學(xué)，才知道這樣操作是不對(duì)的。正確的操作應(yīng)該是不斷地補(bǔ)充染液，以免染液變干，起不到染色的效果。所以，開始時(shí)自己的染液大概一分鐘后就干了，之后的時(shí)間其實(shí)染液是沒有起到染色作用的，所以染出的效果都不理想。另外，像大腸桿菌這樣較難上色的，可能應(yīng)該加長(zhǎng)染色的時(shí)間，以使其呈現(xiàn)出紅色。七、實(shí)驗(yàn)感想本次試驗(yàn)使我們接觸到了非?；A(chǔ)的微生物革蘭染色法，感覺收獲還是頗多的。預(yù)習(xí)時(shí)，感覺操作非常得簡(jiǎn)單，只是按照流程染幾次色便好了。但真正操作的時(shí)候才發(fā)現(xiàn)，這是一個(gè)對(duì)操作規(guī)范性要求很高的實(shí)驗(yàn)。任何一個(gè)細(xì)節(jié)處理得不好，就很難染出理想的效果。而且，許多操作都需要經(jīng)驗(yàn)來把握，并不是僅僅小心去應(yīng)對(duì)就夠了。所以往往一種細(xì)菌，我們要染出兩三個(gè)裝片，才能從中挑選出一個(gè)效果不錯(cuò)的。也正是這個(gè)原因，我們的實(shí)驗(yàn)做到了晚上六點(diǎn)。不過我覺得，第一次難免都會(huì)遇到許多問題，這是不可避免的。而有了這次的經(jīng)驗(yàn)后，之后再用到類此的方法，我們就能操作得更加自如和熟練。另外，革蘭氏染色法是鑒別菌種的一個(gè)極常用的方