種子的制備技術(shù)-生產(chǎn)種子制備技術(shù)（微生物發(fā)酵）

微生物發(fā)酵技術(shù)-車間種子制備車間種子制備流程及設(shè)備01注意事項0203接種方式04質(zhì)量標準流程：

斜面、搖瓶或米粒種子

培養(yǎng)基配制→實罐/連續(xù)滅菌→冷卻→火圈/壓差接種

→培養(yǎng)→發(fā)酵罐種子。設(shè)備：種子罐設(shè)備：種子罐設(shè)備：種子罐/發(fā)酵罐設(shè)備圖制備過程中應(yīng)保持：培養(yǎng)基要求與發(fā)酵培養(yǎng)基大致相同，較搖瓶培養(yǎng)基豐富，控制培養(yǎng)基成份的合理配比2)接種方式：一級種子罐：火圈保護接種法和壓差法二級種子罐：壓差法3）通氣培養(yǎng)時通入空氣的溫度適中（20-50℃），攪拌轉(zhuǎn)速也要適當。4）采用夾套或蛇管冷卻以保持恒溫，溫度不能高于控制溫度，防止造成異常發(fā)酵5）通過培養(yǎng)基中生理酸堿性物質(zhì)的配比，使pH自然維持在適宜的范圍6）控制合適移種量：過大或過小都對發(fā)酵有不利影響流程：注意事項：壓差法接種操作示意流程：注意事項：從種子罐接種注意事項：種子罐1

發(fā)酵罐1發(fā)酵罐2種子罐2

1）單種

2）雙種：二只種子罐接一只發(fā)酵罐

3）倒種：將發(fā)酵液倒出適量給另一發(fā)酵罐作種子

4）混種1）不污染雜菌；2）菌體生長階段（種齡）：處于對數(shù)生長期后期，菌體量未達到高峰；3）菌體濃度：菌體濃度的測定方法：離心沉淀法、光密度法、細胞記數(shù)法等；4）糖、氮、磷代謝情況；5）種子液pH；6）搖瓶試驗的發(fā)酵水平；7）特異性酶活力。種子過于年輕：前期生長緩慢、整個發(fā)酵周期延長、產(chǎn)物開始形成的時間推遲，甚至會因菌絲量過少而在發(fā)酵罐內(nèi)結(jié)球，造成異常發(fā)酵的情況。過老的種子：引起生產(chǎn)能力下降而菌絲過早自溶。一般細菌種子培養(yǎng)7-24h，霉菌16-50h，放線菌21-64h。簡要介紹壓差接種法注意事項。1車間種子接種方式有哪些？2微生物發(fā)酵技術(shù)-米孢子米孢子概述01工藝流程0203注意事項04質(zhì)量檢查定義：將霉菌或放線菌接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時間后產(chǎn)生的分生孢子。以米粒作為培養(yǎng)基，進行種子擴培。流程：包括三部分：1.營養(yǎng)液配制2.米粒培養(yǎng)基制備3.斜面種子。制備過程中應(yīng)保持：

（1）浸泡時間及加營養(yǎng)液量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透但不粘連；（2）分裝量應(yīng)掌握在平鋪后有2-3粒米的厚度；（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培養(yǎng)前期應(yīng)經(jīng)常搖動米粒，使微生物在米粒表面生長均勻，氣生菌絲及孢子長成后不再搖動；（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%-20%甘油浸泡保存。米孢子質(zhì)量應(yīng)遵循：

（1）無雜菌污染；（2）孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高；（3）生產(chǎn)能力高；

(4)真空干燥后含水量小于8%。米孢子制備工藝流程是怎樣的？1米孢子質(zhì)量如何保證？2微生物發(fā)酵技術(shù)

-噬菌體防治噬菌體的防治噬菌體侵染表現(xiàn)01噬菌體防治措施021.噬菌體侵染表現(xiàn)簡介：不同發(fā)酵類型遭到不同種類噬菌體侵染所出現(xiàn)的現(xiàn)象是不同的；而同一菌種被相同的噬菌體侵染，由于侵染的時間不同，也會造成不同的后果。表現(xiàn)1：感染噬菌體后種子出現(xiàn)畸形菌絲，菌體迅速消失；這是因為噬菌體侵染菌種細胞后會快速完成自身生活史周期，利用菌種的代謝體系大量合成子代噬菌體組成部分，完成組裝、釋放并再次侵染周邊菌種細胞，并周而復始的進行侵染、合成、裂解生產(chǎn)菌種細胞造成的。表現(xiàn)2：感染噬菌體后種子培養(yǎng)液會pH上升，發(fā)酵產(chǎn)物停止積累，甚至下降等現(xiàn)象。菌種密度的下降直接表現(xiàn)為產(chǎn)物積累量的下降。2.噬菌體防治措施1.正確判斷：以谷氨酸發(fā)酵為例，感染噬菌體后異常表現(xiàn)為：1、發(fā)酵液泡沫多，粘度大，甚至呈粘膠狀，可撥絲；2、發(fā)酵液OD值上升后下跌，或不長；3、pH上升到8.0以上，且不再下降，或pH稍有升降，停滯在7.0～7.2之間；4、耗糖緩慢或停止；5、排出CO2量一反常態(tài)，急驟下降；6、發(fā)酵周期逐罐延長。此表現(xiàn)可以表述為發(fā)酵異常、動力消耗異常、排氣異常……2.普及有關(guān)噬菌體的知識：噬菌體來源一般為環(huán)境，對種子制備過程中涉及的人員要加強培訓；對周邊環(huán)境要勤消毒；嚴格管理種子實驗室；……3.選育抗噬菌體菌株：從自然突變或誘發(fā)突變所得到的抗噬菌體菌株，在用于生產(chǎn)之前，均需經(jīng)過反復驗證，才能使用。（l）抗噬菌體性狀的穩(wěn)定性試驗抗性菌株分別在孢子培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)過程中用點滴法或雙層瓊脂法測定噬菌斑。如都不出現(xiàn)噬菌斑，說明該菌株對此噬菌體具有抗性。此外，還可以觀察抗性菌株經(jīng)多次傳代后對噬菌體的抗性是否穩(wěn)定。（2）抗性菌株的產(chǎn)量試驗在選育抗噬菌體菌株時，既要求具有抗性，同時亦要求生產(chǎn)能力不低于原敏感菌株。（3）其正抗性與溶源性的區(qū)別試驗菌株的抗噬菌體特性具有遺傳的相對穩(wěn)定性。4.消滅噬菌體：在發(fā)生噬菌體感染時發(fā)酵罐排出的廢氣夾帶有大量噬菌體，造成嚴重污染和擴散。因此，必須在排氣口及下水道噴灑藥劑，防止噬菌體擴散。常用的藥物有漂白粉、甲醛、石灰水等。種子室應(yīng)盡量設(shè)法與外界減少接觸，嚴格執(zhí)行無菌操作，并檢查空氣中有無噬菌體存在。5.收集和保存噬菌體：在生產(chǎn)上出現(xiàn)噬菌體后要收集并保藏起來，以進行研究。因為這是選育抗性菌株及研究防治措施的材料和依據(jù)。小結(jié)：總之，防治噬菌體，應(yīng)以預(yù)防為主，杜絕噬菌體的滋生，兩者結(jié)合，才是有效的防治措施。

如何判斷發(fā)酵罐感染噬菌體？1如何消滅罐內(nèi)及環(huán)境中的噬菌體？2微生物發(fā)酵技術(shù)-搖瓶種子制備搖瓶種子制備概述01工藝流程0203注意事項及設(shè)備04質(zhì)量檢查定義：將斜面種子或米孢子接種于錐形搖瓶內(nèi)的液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子。用搖床旋轉(zhuǎn)供氧，進行種子擴培。流程：注：一定是冷卻至室溫后接種，也可于種子適溫時接種；震蕩頻率即供氧速率，由搖床轉(zhuǎn)速控制。培養(yǎng)基配制

分裝錐形瓶

加塞或覆蓋八層紗布

滅菌

冷卻

接種

震蕩培養(yǎng)

液體培養(yǎng)物

斜面種子制備過程中應(yīng)保持：營養(yǎng)成分較斜面豐富；培養(yǎng)基裝量適當參考裝量為40-50ml/250ml瓶，60-80ml/500ml瓶，90-110ml/750ml瓶，120-150ml/1000ml瓶；如果是厭氧培養(yǎng)，則裝量應(yīng)增加一倍以上；滅菌時加蓋牛皮紙或雙層報紙；注意搖床轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速越快，偏心距越大，通氣越好。經(jīng)常檢查，皮帶松弛時要緊一緊；5）注意搖床中心與邊緣、上層與下層的溫差。流程：注意事項：流程：設(shè)備：流程：設(shè)備：立式旋轉(zhuǎn)搖床流程：設(shè)備：超凈工作臺

搖瓶種子質(zhì)量應(yīng)遵循：菌體濃度：外觀稠度，靜置沉降率，離心沉降率；

菌體生長階段：顯微鏡檢查細胞分化情況；(3)代謝情況：對殘余糖、氮進行化學分析，并測量pH值；(4)

生產(chǎn)能力：搖瓶發(fā)酵試驗；(5)

污染雜菌情況：鏡檢及無菌試驗檢查。搖瓶種子制備過程為怎樣的流程？1搖瓶種子質(zhì)量如何檢驗？2微生物發(fā)酵技術(shù)

-種子的擴大培養(yǎng)種子的擴大培養(yǎng)種子擴培概述01種子培養(yǎng)方法0203種子擴培工藝04種子擴培參數(shù)1.種子擴培概述定義：種子擴大培養(yǎng)，簡稱種子擴培，是指將保存的處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)而獲得的供生產(chǎn)車間發(fā)酵罐接種用的一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。廣義的種子：是指利用微生物生產(chǎn)中所用到的各種孢子、搖瓶菌絲、種子罐菌絲的總稱。狹義的種子：指用于接種的各種菌絲。作用：發(fā)酵接種量的需要；菌種的馴化需要；縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平需要……2.種子培養(yǎng)方法表面培養(yǎng)法：指表面皿培養(yǎng)，液面形成生物膜。特點：接近自然，但種子生長速度慢。常用茄子瓶、克氏瓶、瓷盤培養(yǎng)。固體培養(yǎng)法：用天然的固體物料培養(yǎng)，另加入生長因子、微量元素以補充養(yǎng)料。不使用瓊脂，和1中的固體培養(yǎng)基不同。主要用于孢子制備，大規(guī)模生產(chǎn)也有應(yīng)用，養(yǎng)分傳遞慢，生長較慢，也易染菌。常用三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶和培養(yǎng)皿等。液體深層培養(yǎng)法：將孢子懸浮于培養(yǎng)基中，物質(zhì)、氧的傳遞快、生長快，工業(yè)生產(chǎn)主要用此法，也用于一級、二級種子罐。3.種子擴培工藝實驗室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此形象地將這些培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。如包括瓊脂斜面、固體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)或搖瓶液體培養(yǎng)。車間種子階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工廠歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。如種子罐擴大培養(yǎng)。擴培一般工藝流程：斜面沙土管冷干管液氮管實驗室種子制備生產(chǎn)現(xiàn)場種子制備

二級斜面一級斜面米孢子

母瓶

子瓶

一級種子罐發(fā)酵罐

二級種子罐三級種子罐菌種保藏4.種子擴培參數(shù)接種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。

通常，接種齡以菌絲處于對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體量還未達到最高峰時較為合適。種子罐級數(shù)：種子在種子罐中需擴大培養(yǎng)的次數(shù)。一般根據(jù)菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及所采用發(fā)酵罐的容積而定。谷氨酸及其他氨基酸發(fā)酵所采用的菌種生產(chǎn)繁殖很快，常用一級種子擴大培養(yǎng)；慶大霉素、卡那霉素一般用二級種子擴大培養(yǎng)；有些酶制劑生產(chǎn)也用二級種子擴大培養(yǎng)；鏈霉素采用三級種子擴大培養(yǎng)；放線菌的細胞生長繁殖較慢，常采用三級種子擴大培養(yǎng)；種子罐的級數(shù)越少，越利于簡化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來染菌的機率。發(fā)酵級數(shù)：種子罐級數(shù)+1：谷氨酸及其他氨基酸發(fā)酵常用一級種子擴大培養(yǎng)，即二級發(fā)酵；慶大霉素、卡那霉素一般用二級種子擴大培養(yǎng)，即三級發(fā)酵；有些酶制劑生產(chǎn)也用二級種子擴大培養(yǎng)，即三級發(fā)酵；鏈霉素采用三級種子擴大培養(yǎng)，即四級發(fā)酵；放線菌的細胞生長繁殖較慢，常采用三級種子擴大培養(yǎng)，即四級發(fā)酵；必須考慮應(yīng)該盡量延長發(fā)酵罐生產(chǎn)產(chǎn)物的時間，縮短由于種子發(fā)芽、生長而占用的非生產(chǎn)時間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。接種量：指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。種子擴大培養(yǎng)的一般流程是什么？1種子罐級數(shù)和發(fā)酵級數(shù)的關(guān)系？2微生物發(fā)酵技術(shù)-種子異常情況種子異常情況菌種生長發(fā)育過快或緩慢01菌絲結(jié)團02菌絲粘壁03菌種生長發(fā)育過快或緩慢空氣溫度偏低；培養(yǎng)基滅菌溫度太高，營養(yǎng)成分破壞多。（生產(chǎn)中，培養(yǎng)基滅菌后取樣測定PH，以判斷培養(yǎng)基的滅菌質(zhì)量）；局部燙傷；培養(yǎng)基原材料質(zhì)量差；無機磷量低；接種量太??；前一級種子質(zhì)量太差；泡沫多，通氣差。菌絲結(jié)團：在液體培養(yǎng)條件下，繁殖的菌絲并不分散舒展而聚成團狀，稱為菌絲團，這時從培養(yǎng)液的外觀就能看見白色的小顆粒。

菌絲聚集成團有什么影響？如果種子液中的菌絲團較少，進入發(fā)酵罐后，在良好的條件下，可以逐漸消失，不會對發(fā)酵產(chǎn)生顯著影響。如果菌絲團較多，種子液移入發(fā)酵罐后往往形成更多的菌絲團，影響發(fā)酵的正常進行。菌絲結(jié)團和攪拌效果差、接種量小有關(guān)。一個菌絲團可由一個孢子生長發(fā)育而來，也可由多個菌絲體聚集一起逐漸形成。菌絲粘壁菌絲粘壁是指在種子培養(yǎng)過程中，由于攪拌效果不好、泡沫過多以及種子罐裝料系數(shù)過小等原因，使菌絲逐步粘在罐壁上。其結(jié)果使培養(yǎng)液中菌絲濃度減少，最后就可能形成菌絲團。以真菌為產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)過程中，發(fā)生菌絲粘壁的機會較多。菌種過緩或過快生長的原因有哪些？1菌絲粘壁主要原因在哪幾個方面？2微生物發(fā)酵技術(shù)-種子質(zhì)量影響因素種子質(zhì)量影響因素原材料質(zhì)量01培養(yǎng)條件02種齡03接種量04種子質(zhì)量影響因素原材料質(zhì)量：原材料質(zhì)量的波動，起主要作用的是其中無機離子；水質(zhì)對孢子質(zhì)量影響也很大。一些廠家在蒸餾水或去離子水，加入適量的無機鹽制成合成水，可提高孢子質(zhì)量。種子質(zhì)量影響因素培養(yǎng)條件：（l）溫度溫度過低，菌體生長緩慢，延長種子制備時間，增加了發(fā)酵周期，降低企業(yè)經(jīng)濟效益；溫度高，菌體生長快，可