分子生物學(xué)的酶學(xué)基礎(chǔ)

分子生物學(xué)的酶學(xué)基礎(chǔ)概述核酸酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第二節(jié)

甲基化酶第三節(jié)

DNA聚合酶第四節(jié)

其它酶圖4-1基因工程概略

基因組DNA目的基因目的基因基因載體重組體(復(fù)制子)基因重組核酸核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶磷酸酶基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測(cè)等表4－1核酸酶（nuclease）

定義：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。分類據(jù)酶切方式分為：核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶據(jù)底物不同分為：DNA酶和RNA酶

核酸酶

核酸外切酶：編號(hào)為EC3.1,11-16

從核酸分子的末端開始，一個(gè)核苷酸一個(gè)核苷酸的消化降解多核苷酸鏈。核酸外切酶是非特異性的磷酸二酯鍵的酶，如蛇毒磷酸二酯酶是從DNA或RNA的游離3ˊ-羥基端開始，逐個(gè)水解下5ˊ-核苷酸，牛脾磷酸二酯酶則相反，從游離5ˊ-羥基端開始，逐個(gè)水解下3ˊ-核苷酸。核酸酶

核酸內(nèi)切酶：編號(hào)為EC3.1,21-31

核酸內(nèi)切酶特異地切割斷裂多核苷酸內(nèi)部磷酸二酯鍵，它們是特異性強(qiáng)的磷酸二酯酶.

如：牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵生成嘧啶核苷-3ˊ-磷酸或末端為嘧啶核苷-3ˊ-磷酸的寡核苷酸。如RnaseA也叫牛胰核糖核酸酶具有一定的專一性。

RnaseT（從米曲霉制備得到的酶）：專一性切開，鳥苷酸3-P與相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵。產(chǎn)物是3ˊ-鳥苷酸和末端帶有3ˊ-鳥苷酸低聚核苷酸。5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶一、限制與修飾二、限制酶識(shí)別的序列

三、限制酶產(chǎn)生的末端四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

五、位點(diǎn)偏愛六、酶切反應(yīng)條件七、星星活性八、單鏈DNA的切割九、酶切位點(diǎn)的引入十、影響酶活性的因素

十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性一、限制與修飾

（Restrictionandmodification）

1．限制與修飾現(xiàn)象

20世紀(jì)30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。到上世紀(jì)50年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時(shí)稱作寄主控制的專一性（hostcontrolledspecificity）。

一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A成為N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成為5‘甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。

噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題。

在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)會(huì)受到限制。

EcoliK株噬菌體

EcoliK株其他Ecoli菌株圖4－2限制現(xiàn)象E.coli菌株

噬菌體感染率

K

B

CE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111

一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

如表4-2，說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的DNA。10-4

的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時(shí)限制系統(tǒng)還未起作用。而在C菌株不能限制來自K和B菌株的DNA。表4-2

噬菌體在不同宿主菌的轉(zhuǎn)化率一、限制與修飾1．限制與修飾現(xiàn)象

由兩種酶來控制核酸限制性內(nèi)切酶：降解進(jìn)入細(xì)胞的外源含有其識(shí)別的特定位點(diǎn)的核酸。修飾的甲基化酶：對(duì)內(nèi)源含同樣序列的核酸進(jìn)行甲基化，使限制性內(nèi)切酶是無法作用的一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

核酸限制性內(nèi)切酶

定義：能識(shí)別并水解外源雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別DNA雙鏈上的特定位點(diǎn)，按對(duì)稱順序?qū)蓷l鏈切斷，稱為限制性內(nèi)切酶，也稱限制酶。作用特點(diǎn)：①專一性很強(qiáng)；②對(duì)底物DNA有特異的識(shí)別位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的長(zhǎng)度一般在4-8堿基對(duì)范圍，底物通常具有回文結(jié)構(gòu)，切割后形成粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶

能識(shí)別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。切割不同來源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價(jià)值（“分子手術(shù)刀”）。5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸內(nèi)切酶一、限制與修飾

（Restrictionandmodification）

1．限制與修飾現(xiàn)象

限制性內(nèi)切酶和它的“搭檔”--甲基化酶一起就構(gòu)成了寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象，即限制-修飾（R-M）系統(tǒng)，該系統(tǒng)類似于免疫體系。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能。而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行。

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

20世紀(jì)60年代，人們就注意到DNA在感染宿主后會(huì)被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。其中W．Arber于1962年提出一個(gè)假設(shè)來解釋上述現(xiàn)象。他認(rèn)為這是細(xì)菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。

1968年，首次從E.coliK中分離到限制酶，它有特定的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特定的切割位點(diǎn)，其中切割位點(diǎn)離識(shí)別位點(diǎn)達(dá)1000bp以上。

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

1970年，美國(guó)約翰·霍布金斯大學(xué)的H.Smith于偶然中發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細(xì)胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，從而找到HindⅡ限制性內(nèi)切酶。

HindⅡ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多，并且許多已經(jīng)在實(shí)踐中得到應(yīng)用。

EcoRⅠ是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點(diǎn)和切割位點(diǎn)如下：

5'G↓AATTC3'

3'CTTAA↑G5'

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則，主要依據(jù)來源來定，涉及宿主的種名、菌株號(hào)或生物型現(xiàn)采用的是Smith和Athens提議的方案。

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

命名時(shí)，名稱的第個(gè)1字母來源于宿主菌屬名的第1個(gè)字母，大寫；第2，3二個(gè)字母來源于宿主菌種名的頭2個(gè)字母，小寫如果來源菌還有株系，則有第4個(gè)字母；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號(hào)，即發(fā)現(xiàn)的先后順序。前三個(gè)字母用斜體表示，后面字母用正體。

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

如HindⅢ限制性內(nèi)切酶代表從流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分離到的第3個(gè)限制酶，Hin指來源于流感嗜血桿菌，d表示來自菌株Rd，Ⅲ表示序號(hào)。以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加R或M，且菌株號(hào)和序號(hào)小寫，但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的R省略不寫。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

根據(jù)酶的亞單位組成、識(shí)別序列的種類和是否需要輔助因子等因素，限制與修飾系統(tǒng)一般劃分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。然而，蛋白測(cè)序的結(jié)果表明，限制性內(nèi)切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，則應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這三種。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多亞基雙功能蛋白復(fù)合體，對(duì)DNA的甲基化和切割由同一種酶來完成。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈。以前人們認(rèn)為I型限制性內(nèi)切酶很稀有，但現(xiàn)在通過對(duì)基因組測(cè)序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一類酶其實(shí)很常見。從蛋白的角度來看，該系統(tǒng)的種類很少，只占1%。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)由3種亞基S、M、R組成：①S亞基為識(shí)別亞基，可以識(shí)別夾著一定任意堿基對(duì)長(zhǎng)度兩邊的特定序列。②M亞基具有甲基化酶活性，需甲基由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供。③R亞基具有限制酶活性，可在遠(yuǎn)離識(shí)別位點(diǎn)1kb以上處隨機(jī)進(jìn)行切割。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亞基和M亞基）各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中，另外還有負(fù)責(zé)識(shí)別DNA序列的S亞基，分別由hsdR、hsdM和hsdS基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。

EcoK編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M2S，

EcoB編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M4S2

。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

EcoB酶的識(shí)別序列為

TGA*（N）8TGCT，即識(shí)別一端為TGA，另一端為TGCT，中間夾著8個(gè)任意堿基的序列；其中兩條鏈中的A為甲基化位點(diǎn)，N表示任意堿基。

EcoK酶的識(shí)別序列為

AA°C（N）6GTGC，其中兩條鏈中的A為可能的甲基化位點(diǎn)。

但是

EcoB酶和

EcoK酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)1000bp以外，且無特異性

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

如DNA兩條鏈都已甲基化，類型I酶不對(duì)其進(jìn)行切割如只有一條鏈甲基化，則類型I酶使另一條鏈甲基化如兩條鏈都未甲基化，則發(fā)生隨機(jī)切割作用，使

DNA變成短的碎片。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

I型酶在生化研究中很有意義，其可以識(shí)別DNA序列中特定的核苷酸序列，但它的切割作用是在離識(shí)別特異性位點(diǎn)至少1000bp的地方隨機(jī)發(fā)生的，產(chǎn)生不確定的限制片段和不明確的跑膠條帶，因而不具備實(shí)用性，在基因克隆中沒有什么實(shí)用價(jià)值。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá)93%。

II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實(shí)際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過程中各自獨(dú)立產(chǎn)生的，而非來源于同一個(gè)祖先。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

基本特性1、一般性狀最適pH為6～8；

NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護(hù)作用，對(duì)熱不穩(wěn)定，通常是溶于含有50％甘油的緩沖液中貯存于–20℃環(huán)境下，取出使用時(shí)必須立即置于冰浴中。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

II型限制性內(nèi)切酶的基本特性2、識(shí)別序列

多數(shù)限制酶的識(shí)別序列為回文對(duì)稱序列（上海自來水來自海上），通常的識(shí)別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。切割位置因酶而異，有些是隔開的；常在識(shí)別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶3‘-羥基和5’-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

基本特性2、識(shí)別序列識(shí)別位點(diǎn)有些是連續(xù)的：EcoRIG↓AATTC。有些是不連續(xù)的：SatIGC↓NGC

識(shí)別位點(diǎn)的共同特征是具有回文結(jié)構(gòu)，即雙重螺旋對(duì)稱的結(jié)構(gòu)形式

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)2、識(shí)別序列

和類型I酶相同，類型II酶只對(duì)2條鏈都沒有甲基化的DNA進(jìn)行切割，對(duì)1條鏈甲基化的使另一條鏈甲基化，

2條鏈都甲基化的不發(fā)生作用。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性3、酶切切口

有些酶在識(shí)別序列內(nèi)的對(duì)稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端；

SmaICCC↓GGGGGG↑CCC

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性3、酶切切口

很多限制酶不能精確地在2個(gè)對(duì)稱軸部位切割，而在識(shí)別序列2條鏈對(duì)應(yīng)位上錯(cuò)位切割，切割產(chǎn)物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些為3’-突出的粘性末端。

EcoRI位點(diǎn)G↓AATTCCTTAA↑G

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性（4）限制片斷末端的連接作用分為：分子間連接和分子內(nèi)連接許多種限制酶切割DNA分子形成的短片斷能夠自發(fā)的重新環(huán)化起來，環(huán)化分子加熱后又會(huì)重新線性化。但是，如果馬上使用連接酶處理，使他們的3-OH基團(tuán)和5-P基團(tuán)之間封閉起來，環(huán)化就是永久的了。酶切形成的粘性末端任何一側(cè)都能和另一末端互補(bǔ)配對(duì)，使任何含有該識(shí)別序列的DNA分子都能和另一個(gè)含相同識(shí)別序列的DNA分子容易地連接成新的重組分子（4）限制片斷末端的連接作用5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’（4）限制片斷末端的連接作用

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)可以分為三種第一種，在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶

最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI，這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個(gè)氨基酸左右，大部分都以同源二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識(shí)別的是對(duì)稱序列。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)可以分為三種第一種，在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識(shí)別非對(duì)稱序列。一些酶識(shí)別連續(xù)的序列（如EcoRI識(shí)別GAATTC）；而另一些識(shí)別不連續(xù)的序列（如BglI識(shí)別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個(gè)3’羥基端和一個(gè)5’磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子，而相應(yīng)的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷（SAM）的存在。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第二種，IIs型（移動(dòng)切割限制酶）

比較常見，占5%，具有輔因子要求，比如FokI和AlwI。這些酶的大小居中，約為400-650個(gè)氨基酸左右，有一個(gè)結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)的域和一個(gè)專門切割DNA的功能域。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)第二種，IIs型（移動(dòng)切割限制酶）其識(shí)別位點(diǎn)是連續(xù)的非對(duì)稱序列，長(zhǎng)度為4-7bp，在識(shí)別位點(diǎn)之外切開DNA，切割位點(diǎn)可能在識(shí)別位點(diǎn)一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。

因此一些IIS型的酶在切割有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的DNA分子時(shí)，活性可能更高。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)第二種，IIs型（移動(dòng)切割限制酶）

1）具有特異型核苷酸順序識(shí)別能力，但該順序不具有對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即其識(shí)別位點(diǎn)是連續(xù)的非對(duì)稱序列，長(zhǎng)度為4-7bp。

2）酶切位點(diǎn)與識(shí)別位點(diǎn)不一致，切點(diǎn)常在識(shí)別位點(diǎn)的一側(cè)，1--20bp。因此一些IIS型的酶在切割有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的DNA分子時(shí)，活性可能更高。3）酶切后的末端經(jīng)補(bǔ)平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。4）產(chǎn)生粘性末端可以是1--5個(gè)核苷酸。5）均為單體，分子量為47—108kD。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第三種，II型限制性內(nèi)切酶（有時(shí)也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶）是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個(gè)堿基組成，在同一條多肽鏈上同時(shí)具有限制和修飾酶活性。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們?cè)贜端由一個(gè)負(fù)責(zé)切開DNA的功能域，這個(gè)域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個(gè)識(shí)別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨(dú)立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時(shí)，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第三種，II型限制性內(nèi)切酶有些酶識(shí)別連續(xù)序列，并在識(shí)別位點(diǎn)的一端切開DNA鏈；而另一些酶識(shí)別不連續(xù)的序列（如BcgI：CGANNNNNNTGC），并在識(shí)別位點(diǎn)的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識(shí)別序列的片段。表4-3一些類型II限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)和切割部位限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)和切割部位限制性內(nèi)切酶作用位點(diǎn)和切割部位BamHI(5’)G↓GATCC(3’)CCTAG↑GHind

III(5’)A↓AGCTT(3’)TTCGA↑AClaI(5’)AT↓CGAT(3’)TAGC↑TANotI(5’)GC↓GGCCGC(3’)CGCCGG↑CGEcoRI(5’)G↓AATTC(3’)CTTAA↑GPstI(5’)CTGC↓AG(3’)GA↑CGTCEcoRV(5’)GAT↓ATC(3’)CTA↑TAGPvuII(5’)CAG↓CTG(3’)GTC↑GAC圖4-3限制性內(nèi)切酶的作用

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個(gè)彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個(gè)亞單位作用在DNA鏈的兩個(gè)互補(bǔ)位點(diǎn)上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，造成一個(gè)切口，這類限制酶也稱切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達(dá)93%。Ⅱ型酶相對(duì)來說最簡(jiǎn)單，它們識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3‘-羥基和5’-磷酸基團(tuán)的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM。識(shí)別序列主要為4-6bp，或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

在其識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近的確定位點(diǎn)特異地切開DNA鏈，特異性最強(qiáng)，產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類，在基因工程中大量使用，是基因工程中主要的限制酶。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅲ型（typeⅢ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到1%。

是兼有限制-修飾兩種功能的雙亞基酶，M亞基負(fù)責(zé)識(shí)別與修飾，R亞基負(fù)責(zé)切割。它們?cè)谧R(shí)別序列下游24～26bp處切開DNA鏈，并且要求識(shí)別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列。特異性比較差，很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒有人將其商業(yè)化。如EcoP1和EcoP15，它們的識(shí)別位點(diǎn)分別是AGACC和CAGCAG，切割位點(diǎn)則在下游24-26bp處比較內(nèi)容

ⅠⅡⅢ酶分子三亞基雙功能酶內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起二亞基雙功能酶識(shí)別位點(diǎn)二分非對(duì)稱4-6bp,大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)5-7bp非對(duì)稱切割位點(diǎn)無特異性，至少在識(shí)別位點(diǎn)外1000bp在識(shí)別位點(diǎn)中或靠近識(shí)別位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)互斥分開的反應(yīng)同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)限制作用是否需用ATPYesNoYes

表4－4各種限制與修飾系統(tǒng)的比較

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類：基因工程的工具酶。Ⅲ類：切割位點(diǎn)不在識(shí)別位點(diǎn)，一般離識(shí)別位點(diǎn)25bp～27bp，對(duì)分子克隆操作亦無實(shí)用意義。

在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指Ⅱ型系統(tǒng)中的種類。

一、限制與修飾

5．限制酶發(fā)現(xiàn)與鑒定的現(xiàn)狀

從大小上來說，它們限制性內(nèi)切酶可以小到如PvuII（157個(gè)氨基酸），也可以比1250個(gè)氨基酸的CjeI更大。

1986年下半年發(fā)現(xiàn)615種限制酶和98種甲基化酶；1998年發(fā)現(xiàn)10000種細(xì)菌或古細(xì)菌中存在3000種酶，且酶有200多種特異性。到2005年1月，共發(fā)現(xiàn)4342種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681種，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有59、3612、10種，甲基化指導(dǎo)的限制酶有3種，商業(yè)化的限制酶有588種，在Ⅱ型限制酶中共有221種特異性。

二、限制酶識(shí)別的序列

1．限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度

限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度一般為4-8個(gè)堿基，最常見的為6個(gè)堿基（表4－3）。當(dāng)識(shí)別序列為4個(gè)和6個(gè)堿基時(shí)，它們可識(shí)別的序列在完全隨機(jī)的情況下，平均每256個(gè)和4096個(gè)堿基中會(huì)出現(xiàn)一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)（44=256，46=4096）。

以下是幾個(gè)有代表性的種類，箭頭指切割位置。

4個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：Sau3AⅠ↓GATC

5個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG

6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT

7個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY

8個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)：NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的堿基如下。

R=A或GY=C或TM=A或C

K=G或TS=C或GW=A或T

H=A或C或TB=C或G或TV=A或C或G

D=A或G或TN=A或C或G或TNNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）電泳

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的識(shí)別序列HaeⅠ的識(shí)別序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識(shí)別序列和酶切切口（平端）二、限制酶識(shí)別的序列2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

限制酶識(shí)別的序列大多數(shù)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，切割位點(diǎn)在DNA兩條鏈相對(duì)稱的位置。

EcoRⅠ和HindⅢ的識(shí)別序列和切割位置如下。

EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A

二、限制酶識(shí)別的序列2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶的識(shí)別序列不是對(duì)稱的，如

AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]和

BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]，識(shí)別序列后面括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置。

AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C二、限制酶識(shí)別的序列2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶可識(shí)別多種序列，如

AccⅠ識(shí)別的序列是GT↓MKAC，也就是說可識(shí)別4種序列，其中兩種是對(duì)稱的，另兩種是非對(duì)稱的。

HindⅡ識(shí)別的序列是GTY↓RAC。二、限制酶識(shí)別的序列2．限制酶識(shí)別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶識(shí)別的序列呈間斷對(duì)稱，對(duì)稱序列之間含有若干個(gè)任意堿基。如

AlwNⅠ和DdeⅠ，它們的識(shí)別序列如下。

AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAG

GT↑CNNNGACGANT↑C二、限制酶識(shí)別的序列3．限制酶切割的位置

限制酶對(duì)DNA的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。

切點(diǎn)在兩端的有

Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和

EcoRⅡ（↓CCWGG）等；二、限制酶識(shí)別的序列3．限制酶切割的位置

在兩側(cè)的有BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和

TspRⅠ（CASTGNN↓），

BcgⅠ酶的切割特性與其它酶不同，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)的兩端各切開一個(gè)斷點(diǎn)，而不是只產(chǎn)生一個(gè)斷點(diǎn)。

BcgⅠ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓TspRⅠNNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑

↑NNGTG（C）ACNN

切點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)外側(cè)的還有BbvⅠ[GCAGC（8/12）]和

BspMⅠ[ACCTGC（4/8）]等。表4－5內(nèi)切酶為4，6bp回文結(jié)構(gòu)的識(shí)別序列和酶切位點(diǎn)

三、限制酶產(chǎn)生的末端

1．限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matchedends）

識(shí)別位點(diǎn)為回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），這樣形成的兩個(gè)末端是相同的，也是互補(bǔ)的。若在對(duì)稱軸5'側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯(cuò)斷開產(chǎn)生5'突出粘性末端，如

EcoRⅠ；若在3'-側(cè)切割，則產(chǎn)生3'突出粘性末端，如

KpnⅠ。

EcoRⅠ

5

NNG↓AATTCNN

3

3NNCTTAA↑GNN5三、限制酶產(chǎn)生的末端

2．限制酶產(chǎn)生平末端（Bluntend）

在回文對(duì)稱軸上同時(shí)切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。產(chǎn)生平末端的DNA可任意連接，但連接效率較粘性末端低。三、限制酶產(chǎn)生的末端

3．限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端

許多限制酶切割DNA產(chǎn)生非對(duì)稱突出端。

當(dāng)識(shí)別序列為非對(duì)稱序列時(shí)，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如

BbvCⅠ的識(shí)別切割位點(diǎn)如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

三、限制酶產(chǎn)生的末端

3．限制酶產(chǎn)生非對(duì)稱突出端

有些限制酶識(shí)別簡(jiǎn)并序列，其識(shí)別的序列中有幾種是非對(duì)稱的。如

AccⅠ，它的識(shí)別切割位點(diǎn)如下，其中GTAGAC和GTCTAC為非對(duì)稱。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶識(shí)別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如DraⅢ和

EarⅠ，它們的識(shí)別切割位點(diǎn)分別是CAC↑NNN↓GTG和CTCTTC（1/4）。三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些來源不同但識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。具體可分為：

①同序同切酶

這些酶識(shí)別序列和切割位置都相同，如HindⅡ與

HincⅡ識(shí)別切割位點(diǎn)為GTY↓RAC，

HpaⅡ與HapⅡ識(shí)別切割位點(diǎn)為C↓CGG，

MobⅠ與

Sau3AⅠ識(shí)別切割位點(diǎn)為↓GATC。三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些來源不同但識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點(diǎn)可能不同。具體可分為：

②同序異切酶

KpnⅠ和

Acc65Ⅰ識(shí)別的序列是相同的，但它們的切割位點(diǎn)不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。另外，Asp718Ⅰ識(shí)別和切割位點(diǎn)為G↓GTACC。

三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

③“同功多位”許多識(shí)別簡(jiǎn)并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)為G↓AATTC，ApoⅠ識(shí)別和切割位點(diǎn)為R↓AATTY，后者可識(shí)別前者的序列。另外，

HpaⅠ和HincⅡ的識(shí)別位點(diǎn)也有交叉，它們的識(shí)別和切割位點(diǎn)分別為GTT↓AAC和

HincⅡ。

三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

④其它有些限制酶識(shí)別的序列有交叉，如在pUC系列質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中有一個(gè)

SalⅠ位點(diǎn)（識(shí)別切割位點(diǎn)為G↓TCGAC），該位點(diǎn)也可被AccⅠ（識(shí)別切割位點(diǎn)為GT↓MKAC）和HincⅡ（識(shí)別切割位點(diǎn)為GTY↓RAC）切割。三、限制酶產(chǎn)生的末端

5．同尾酶

來源各異，識(shí)別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端，且是對(duì)稱的，這些限制酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進(jìn)行粘端連接。如：·

EcoRⅠ

G↓AATCCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTY

·SpeⅠA↓CTAGT

NheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGA·BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATC

StyⅠC↓CWWGG

·ClaⅠAT↓CGAT

AccⅠ

GT↓MKAC（pUC19）三、限制酶產(chǎn)生的末端

6．識(shí)別特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

有些線粒體、葉綠體、核DNA、T偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些intein（proteinsplicingelement）也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為I-prefix和pI-prefix系列內(nèi)切酶，它們識(shí)別的序列很長(zhǎng)。

I-prefix是由在RNA水平上剪切和編碼的，pI-prefix在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物，這類內(nèi)切酶也稱為homingendonuclease，目前商業(yè)化的種類有6種。三、限制酶產(chǎn)生的末端

6．識(shí)別特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

從因特網(wǎng)上可以找到Intein的數(shù)據(jù)庫Inbase（InteinDatabase），該網(wǎng)站由NewEnglandBioLabs公司維護(hù)（）。三、限制酶產(chǎn)生的末端

7．其他限制性內(nèi)切酶

I-CeuI酶是衣滴蟲（Chlamydomonaseugametos）葉綠體大rRNA基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識(shí)別位點(diǎn)為26bp，識(shí)別的核心部位為-12至+7位置的19bp。反應(yīng)溫度為37℃，識(shí)別位點(diǎn)如下，方框內(nèi)為核心識(shí)別序列：TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時(shí)對(duì)識(shí)別序列兩端的非識(shí)別序列有長(zhǎng)度的要求，也就是說在識(shí)別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

用20單位（Units）限制酶切割1

g標(biāo)記的寡核苷酸做測(cè)試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同的酶對(duì)識(shí)別序列兩端的長(zhǎng)度有不同的要求。

EcoRⅠ對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較小，在識(shí)別序列外側(cè)有一個(gè)堿基對(duì)時(shí)在2小時(shí)的切割活性可達(dá)90%。而

AccⅠ和HindⅢ對(duì)兩端的序列長(zhǎng)度要求較大。表4－5靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測(cè)）限制酶待測(cè)的寡核苷酸序列待測(cè)的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0四、DNA末端長(zhǎng)度對(duì)限制酶切割的影響

用DNA片段（線性載體）檢測(cè)末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)識(shí)別序列的末端長(zhǎng)度對(duì)酶切效率有明顯影響，不同的酶對(duì)末端長(zhǎng)度的要求是不同。

在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，如果要在末端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)，為保證能夠順利切割擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計(jì)的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點(diǎn)時(shí)選擇酶切秩序。五、位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）

某些限制酶對(duì)同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割，即對(duì)不同位置的同一個(gè)識(shí)別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點(diǎn)偏愛。五、位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點(diǎn)對(duì)酶的敏感性是不同。λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。

EcoRⅠ酶切割

噬菌體中的5個(gè)位點(diǎn)時(shí)并不是隨機(jī)的，靠近右端的位點(diǎn)比分子中間的位點(diǎn)切割快10倍；EcoRⅠ對(duì)腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切點(diǎn)的切割速率也不同。

EcoRⅠ和HindⅢ在

噬菌體DNA中的切割速率分別有10倍和14倍的差異。五、位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）

噬菌體DNA有4個(gè)SacⅡ位點(diǎn)，三個(gè)在中央，一個(gè)在右臂，對(duì)中央三個(gè)位點(diǎn)的酶切速度快50倍。在φX174噬菌體（單鏈環(huán)狀，5386bp，DNA復(fù)制時(shí)可以雙鏈形式存在）DNA中發(fā)現(xiàn)

HgaⅠ切割某些位點(diǎn)比其它的快。在腺病毒2中，CTCGAG位點(diǎn)對(duì)

PaeR7Ⅰ完全抵抗，但同裂酶

XhoⅠ卻很易切割，原因是5'末端有一個(gè)CT二核苷酸，與甲基化完全無關(guān)。五、位點(diǎn)偏愛（Sitepreference）造成上述現(xiàn)象的原因有以下幾種情況：

NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ三種酶屬于在切割DNA之前需要同時(shí)與兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)作用的一類酶。

BspMⅠ、EcoRⅡ和HpaⅡ則屬另一種情況，它們對(duì)要求作用的DNA序列上有兩個(gè)明顯不同的結(jié)合位點(diǎn)，其中一個(gè)是為DNA切割激活另一個(gè)的變構(gòu)位點(diǎn)（allosteric）。這兩序列可由順式（cis）方式提供，即相互靠近或形成環(huán)（loop）；或由反式（trans）方式提供，其變構(gòu)位點(diǎn)由含識(shí)別序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定pH值的緩沖劑、Mg++、DTT（二硫蘇糖醇）以及BSA（小牛血請(qǐng)白蛋白）。

pH經(jīng)常為7.0-7.9（在25℃時(shí)），用Tris-HCl或乙酸調(diào)節(jié)；

Mg++

作為酶的活性中心，由MgCl2

和MgAc提供，濃度常為10mM；

DTT濃度常為1mM。有時(shí)緩沖液中還要加入100

g/mlBSA，但只是少數(shù)反應(yīng)需要。

六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

不同的酶對(duì)離子強(qiáng)度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強(qiáng)度的差異分為高、中、低三種類型，離子強(qiáng)度以NaCl來滿足，濃度分別為100mM、50mM和0mM。六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

要對(duì)DNA進(jìn)行雙酶切時(shí)，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA可純化或不純化）

六、酶切反應(yīng)條件

2．反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度大多數(shù)為37℃，一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃。高溫作用酶在37℃下的活性會(huì)下降，多數(shù)僅為最適條件下的10-50%。如Taq

限制酶（正常反應(yīng)溫度為65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；

ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為50℃），37℃只有在50℃時(shí)活性的50%。銷售商在產(chǎn)品說明中都會(huì)標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度。

六、酶切反應(yīng)條件

3．反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間通常為1小時(shí)或更多，許多酶延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間可減少酶的用量。

EcoRⅠ反應(yīng)時(shí)間為16小時(shí)，則所用酶量為只切1小時(shí)的1/8。其它一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8；KpnⅠ為1/4；BamHⅠ為1/2。

六、酶切反應(yīng)條件

4．終止酶切的方法

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mM；加熱是常用的方法，對(duì)于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。但是對(duì)于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶，如最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶

BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶

Tth111Ⅰ和

TspRⅠ，以及50℃酶

Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。

七、星星活性（staractivity）

1、定義

在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下，限制酶能切割與識(shí)別序列相似的序列，這個(gè)改變的特殊性稱星星活性。實(shí)際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準(zhǔn)條件下都能切割非典型位點(diǎn)，如

ApoI（2）、AseI（2）、BamHI（3）、BssHII（2）、EcoRI（4）、EcoRV（5）、HindIII（1）、HinfI（6、7）、PstI（8）、PvuII（9）、SalI（8）、ScaI（2）、TaqI（10）、XmnI（2）、KpnⅠ等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號(hào)活性的因素

酶識(shí)別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號(hào)活性的反應(yīng)條件影響，常見的引起酶識(shí)別改變的條件有：

單堿基替換－1個(gè)堿基的變化；

識(shí)別序列外側(cè)堿基縮短－識(shí)別位點(diǎn)外層堿基的隨意性

單鏈切刻－單鏈缺口

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號(hào)活性的因素較高的甘油濃度（>5%v/v）；酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為>100U/

l

）；

離子強(qiáng)度低，即低鹽濃度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有機(jī)溶劑（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）用其他二價(jià)離子替代鎂離子,如Mn2+、Cu2+

、Co2+、Zn2＋等。

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號(hào)活性的因素以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同，如EcoRI比PstI對(duì)甘油濃度更敏感，而后者則對(duì)高pH值更敏感一些。

Polisky等對(duì)EcoRI的早期研究表明，在低鹽濃度、高pH值條件下，EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等的研究表明，只要識(shí)別中心的四堿基序列（AATT）不出現(xiàn)A/T替換，EcoRI可以切割其它任何單堿基替代序列。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星號(hào)活性的方法星星活性在絕大多數(shù)情況下是可控制的盡量用較少的酶進(jìn)行完全消化反應(yīng)，這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。盡量避免有機(jī)溶劑（如制備DNA時(shí)引入的乙醇）的污染。將離子濃度提高到100-150mM（若酶活性不受離子強(qiáng)度影響）。將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。二價(jià)離子用Mg2+。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星號(hào)活性的方法大多數(shù)星號(hào)活性是可以控制的，只要在正常條件下使用隨酶提供的Buffer就不會(huì)出現(xiàn)星號(hào)活性。

八、單鏈DNA的切割

部分切割雙鏈DNA的酶也可消化其單鏈，但是切割效率不同。

HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ切割單鏈DNA的效率是切割雙鏈的50%

HaeⅢ切割單鏈DNA的效率是切割雙鏈的10%

BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ切割單鏈DNA的速度比切割雙鏈慢100倍。

八、單鏈DNA的切割

還有一些酶不切割單鏈DNA，如AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ等等。

有些限制酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，即切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBⅠ。這類酶在命名時(shí)前面要加一個(gè)N，目前已經(jīng)商品化的這類酶共有7種。

N.BstNBⅠ的識(shí)別序列和切割位置如下：

5′...GAGTCNNNNN...3′

3′...CTCAGNNNNN...5′

九、酶切位點(diǎn)的引入

通過酶切和連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)

（1）將產(chǎn)生的5‘突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)

EcoRⅠ

的識(shí)別位點(diǎn)是GAATTC，先用它來切片段，將5'突出端補(bǔ)平后，再連接可產(chǎn)生

XmaⅠ（GAANNNNTTC）和AceⅠ（ATTAAT）酶切位點(diǎn)，而

EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)消失。

……GAATTC……補(bǔ)平

….GAATTAATTC….

連接

….GAATTAATTC…

……CTTAAG……….CTTAATTAAG….….CTTAATTAAG…

對(duì)

HindⅢ位點(diǎn)（AAGCTT）來說，經(jīng)酶切和連接可產(chǎn)生

AluⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)，同時(shí)

HindⅢ位點(diǎn)消失九、酶切位點(diǎn)的引入

（2）同尾末端的連接

不同的同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端再相互連接時(shí)，可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，同時(shí)原來的酶切位點(diǎn)卻消失如BamHⅠ（G↓AATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）→

AlwⅠ（GGATC4/5）

XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或

NheⅠ或SpeⅠ或StyⅠ（CCTAGG）→

BfaⅠ（C↓TAG）也產(chǎn)生了新的酶切位點(diǎn)。九、酶切位點(diǎn)的引入

（3）平端連接平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)，如

PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→

MobⅠ（GATC）。

十、影響酶活性的因素

影響酶切活性的因素有許多，概略的說可分為：外因：反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短等等。內(nèi)因：位點(diǎn)偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時(shí)的活性，如與切割

DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA。

PaeRTⅠ與XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5‘端為CT則

PaeRTⅠ不能切割。十、影響酶活性的因素

1）DNA純度污染在DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、酒精、異丙醇、EDTA、高鹽離子等會(huì)影響酶切。

克服方法：在純化過程中，空轉(zhuǎn)一定要時(shí)間充足、要徹底。用微堿的TE洗脫。提高限制內(nèi)切酶的用量。延長(zhǎng)酶切時(shí)間擴(kuò)大酶切體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)得稀釋。

十、影響酶活性的因素

2）DNA甲基化的程度識(shí)別序列中某些堿基甲基化后會(huì)阻礙酶活性通常從大腸桿菌細(xì)胞中分離的質(zhì)粒DNA，都混有特定核苷酸序列的甲基化酶：DAM甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤殘基甲基化dcm甲基化酶：催化cca\tgg序列中內(nèi)部的胞嘧啶殘基的甲基化。

所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大腸桿菌制備質(zhì)粒DNA。十、影響酶活性的因素

3）酶切消化反應(yīng)溫度酶切標(biāo)準(zhǔn)溫度是37℃

，但是某些特殊的酶最適合溫度是例外的，比如SmaI是30℃

。過高或者過低的溫度會(huì)使內(nèi)切酶失去活性十、影響酶活性的因素

4）DNA的分子結(jié)構(gòu)

DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)限制性內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。當(dāng)DNA分子為線性的時(shí)候最容易，當(dāng)DNA分子存在二級(jí)結(jié)構(gòu)的時(shí)候，酶切的活力就會(huì)大大降低。十、影響酶活性的因素

5）限制性內(nèi)切酶的緩沖液緩沖液一般的組成部分包括：氯化鎂、Tris-HCl,β

－巰基乙醇或者DTT、BSA等。適合的二價(jià)金屬離子濃度，通常為Mg2＋。適合的pH通常為7.4左右。十一、酶切位點(diǎn)在基因組中分布的不均一性

在基因組中堿基對(duì)的排列是非均勻的，因此盡管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機(jī)率還是不一樣。如在

E.coli中，

AsoⅠ（GGCGCGCC）切點(diǎn)平均20kb中出現(xiàn)一個(gè)

NotⅠ（GCGGCCGC）切點(diǎn)平均200kb中出現(xiàn)一個(gè)（常利用它出現(xiàn)的機(jī)會(huì)少來構(gòu)建圖譜）

EcoRⅠ

和HindⅢ切點(diǎn)平均5kb中出現(xiàn)一個(gè)

SpeⅠ（ACTAGT）切點(diǎn)平均60kb中出現(xiàn)一個(gè)。十二、限制性內(nèi)切酶的貯存與應(yīng)用

限制酶對(duì)熱不穩(wěn)定，貯存于-20oC，為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時(shí)添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中