分子生物學(xué)的酶學(xué)基礎(chǔ)

分子生物學(xué)的酶學(xué)基礎(chǔ)概述核酸酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶第二節(jié)

甲基化酶第三節(jié)

DNA聚合酶第四節(jié)

其它酶圖4-1基因工程概略

基因組DNA目的基因目的基因基因載體重組體(復(fù)制子)基因重組核酸核酸水解酶類核酸合成酶類核酸修飾酶類核酸內(nèi)切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA連接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸轉(zhuǎn)移酶磷酸酶基因工程中的工具酶限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細胞的破壁，轉(zhuǎn)化，核酸純化，檢測等表4－1核酸酶（nuclease）

定義：通過切割相鄰的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。分類據(jù)酶切方式分為：核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶據(jù)底物不同分為：DNA酶和RNA酶

核酸酶

核酸外切酶：編號為EC3.1,11-16

從核酸分子的末端開始，一個核苷酸一個核苷酸的消化降解多核苷酸鏈。核酸外切酶是非特異性的磷酸二酯鍵的酶，如蛇毒磷酸二酯酶是從DNA或RNA的游離3ˊ-羥基端開始，逐個水解下5ˊ-核苷酸，牛脾磷酸二酯酶則相反，從游離5ˊ-羥基端開始，逐個水解下3ˊ-核苷酸。核酸酶

核酸內(nèi)切酶：編號為EC3.1,21-31

核酸內(nèi)切酶特異地切割斷裂多核苷酸內(nèi)部磷酸二酯鍵，它們是特異性強的磷酸二酯酶.

如：牛胰核酸酶作用于嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵生成嘧啶核苷-3ˊ-磷酸或末端為嘧啶核苷-3ˊ-磷酸的寡核苷酸。如RnaseA也叫牛胰核糖核酸酶具有一定的專一性。

RnaseT（從米曲霉制備得到的酶）：專一性切開，鳥苷酸3-P與相鄰核苷酸之間的磷酸二酯鍵。產(chǎn)物是3ˊ-鳥苷酸和末端帶有3ˊ-鳥苷酸低聚核苷酸。5’5’GCAATGCTTAGCCATCGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸內(nèi)切酶核酸外切酶第一節(jié)限制性內(nèi)切酶一、限制與修飾二、限制酶識別的序列

三、限制酶產(chǎn)生的末端四、DNA末端長度對限制酶切割的影響

五、位點偏愛六、酶切反應(yīng)條件七、星星活性八、單鏈DNA的切割九、酶切位點的引入十、影響酶活性的因素

十一、酶切位點在基因組中分布的不均一性一、限制與修飾

（Restrictionandmodification）

1．限制與修飾現(xiàn)象

20世紀30年代，微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn)，微生物的噬菌體不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌體只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。這種現(xiàn)象稱為“限制現(xiàn)象”。到上世紀50年代初，有許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)了限制與修飾現(xiàn)象，當(dāng)時稱作寄主控制的專一性（hostcontrolledspecificity）。

一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A成為N6甲基-腺膘呤，胞嘧啶C成為5‘甲基胞嘧啶。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。

噬菌體表現(xiàn)的現(xiàn)象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率可說明這一問題。

在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時會受到限制。

EcoliK株噬菌體

EcoliK株其他Ecoli菌株圖4－2限制現(xiàn)象E.coli菌株

噬菌體感染率

K

B

CE.coliK110-410-4E.coliB10-4110-4E.coliC111

一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

如表4-2，說明K和B菌株中存在一種限制系統(tǒng)，可排除外來的DNA。10-4

的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果，此時限制系統(tǒng)還未起作用。而在C菌株不能限制來自K和B菌株的DNA。表4-2

噬菌體在不同宿主菌的轉(zhuǎn)化率一、限制與修飾1．限制與修飾現(xiàn)象

由兩種酶來控制核酸限制性內(nèi)切酶：降解進入細胞的外源含有其識別的特定位點的核酸。修飾的甲基化酶：對內(nèi)源含同樣序列的核酸進行甲基化，使限制性內(nèi)切酶是無法作用的一、限制與修飾

1．限制與修飾現(xiàn)象

核酸限制性內(nèi)切酶

定義：能識別并水解外源雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶，能識別DNA雙鏈上的特定位點，按對稱順序?qū)蓷l鏈切斷，稱為限制性內(nèi)切酶，也稱限制酶。作用特點：①專一性很強；②對底物DNA有特異的識別位點，這些位點的長度一般在4-8堿基對范圍，底物通常具有回文結(jié)構(gòu)，切割后形成粘性末端或平末端。限制性內(nèi)切酶

能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。切割不同來源的DNA分子將產(chǎn)生特征性限制性酶切圖譜，具有重大應(yīng)用價值（“分子手術(shù)刀”）。5’5’GCAAGCTTTAGCCATCGTTCGAAATCGGTA限制性核酸內(nèi)切酶一、限制與修飾

（Restrictionandmodification）

1．限制與修飾現(xiàn)象

限制性內(nèi)切酶和它的“搭檔”--甲基化酶一起就構(gòu)成了寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象，即限制-修飾（R-M）系統(tǒng)，該系統(tǒng)類似于免疫體系。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨立行使自己的功能。而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來執(zhí)行。

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

20世紀60年代，人們就注意到DNA在感染宿主后會被降解的現(xiàn)象，從而提出限制性切酶和限制酶的概念。其中W．Arber于1962年提出一個假設(shè)來解釋上述現(xiàn)象。他認為這是細菌中有2種以上功能不同的酶，一種是核酸內(nèi)切酶，能識別并切斷外來DNA分子的某些部位，使外來DNA失去活性，限制外來噬菌體的繁殖，把這類酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶。

1968年，首次從E.coliK中分離到限制酶，它有特定的識別位點但沒有特定的切割位點，其中切割位點離識別位點達1000bp以上。

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

1970年，美國約翰·霍布金斯大學(xué)的H.Smith于偶然中發(fā)現(xiàn)，流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）能迅速降解外源的噬菌體DNA，其細胞提取液可降解E.coliDNA，但不能降解自身DNA，從而找到HindⅡ限制性內(nèi)切酶。

HindⅡ限制性內(nèi)切酶位點和切割位點如下：

5'…GTPy↓PuAC…3'

3'…CAPu↑PyTG…5'

一、限制與修飾

2．限制酶的發(fā)現(xiàn)

從此以后，發(fā)現(xiàn)的限制酶越來越多，并且許多已經(jīng)在實踐中得到應(yīng)用。

EcoRⅠ是應(yīng)用最廣泛的限制性內(nèi)切酶，酶切位點和切割位點如下：

5'G↓AATTC3'

3'CTTAA↑G5'

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

限制性內(nèi)切酶的命名遵循一定的原則，主要依據(jù)來源來定，涉及宿主的種名、菌株號或生物型現(xiàn)采用的是Smith和Athens提議的方案。

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

命名時，名稱的第個1字母來源于宿主菌屬名的第1個字母，大寫；第2，3二個字母來源于宿主菌種名的頭2個字母，小寫如果來源菌還有株系，則有第4個字母；最后用大寫羅馬數(shù)字，代表同一菌株中不同限制酶的編號，即發(fā)現(xiàn)的先后順序。前三個字母用斜體表示，后面字母用正體。

一、限制與修飾

3．限制酶的命名

如HindⅢ限制性內(nèi)切酶代表從流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzac)d株中分離到的第3個限制酶，Hin指來源于流感嗜血桿菌，d表示來自菌株Rd，Ⅲ表示序號。以前在限制性內(nèi)切酶和修飾酶前加R或M，且菌株號和序號小寫，但現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶名稱中的R省略不寫。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

根據(jù)酶的亞單位組成、識別序列的種類和是否需要輔助因子等因素，限制與修飾系統(tǒng)一般劃分為I，Ⅱ，Ⅲ三大類。然而，蛋白測序的結(jié)果表明，限制性內(nèi)切酶的變化多種多樣，若從分子水平上分類，則應(yīng)當(dāng)遠遠不止這三種。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多亞基雙功能蛋白復(fù)合體，對DNA的甲基化和切割由同一種酶來完成。它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈。以前人們認為I型限制性內(nèi)切酶很稀有，但現(xiàn)在通過對基因組測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一類酶其實很常見。從蛋白的角度來看，該系統(tǒng)的種類很少，只占1%。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)由3種亞基S、M、R組成：①S亞基為識別亞基，可以識別夾著一定任意堿基對長度兩邊的特定序列。②M亞基具有甲基化酶活性，需甲基由S-腺苷蛋氨酸（SAM）提供。③R亞基具有限制酶活性，可在遠離識別位點1kb以上處隨機進行切割。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)如EcoK和EcoB。其限制酶和甲基化酶（即R亞基和M亞基）各作為一個亞基存在于酶分子中，另外還有負責(zé)識別DNA序列的S亞基，分別由hsdR、hsdM和hsdS基因編碼，屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位）。

EcoK編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M2S，

EcoB編碼基因的結(jié)構(gòu)為R2M4S2

。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

EcoB酶的識別序列為

TGA*（N）8TGCT，即識別一端為TGA，另一端為TGCT，中間夾著8個任意堿基的序列；其中兩條鏈中的A為甲基化位點，N表示任意堿基。

EcoK酶的識別序列為

AA°C（N）6GTGC，其中兩條鏈中的A為可能的甲基化位點。

但是

EcoB酶和

EcoK酶的切割位點在識別位點1000bp以外，且無特異性

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

如DNA兩條鏈都已甲基化，類型I酶不對其進行切割如只有一條鏈甲基化，則類型I酶使另一條鏈甲基化如兩條鏈都未甲基化，則發(fā)生隨機切割作用，使

DNA變成短的碎片。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅰ型（typeⅠ）限制與修飾系統(tǒng)

I型酶在生化研究中很有意義，其可以識別DNA序列中特定的核苷酸序列，但它的切割作用是在離識別特異性位點至少1000bp的地方隨機發(fā)生的，產(chǎn)生不確定的限制片段和不明確的跑膠條帶，因而不具備實用性，在基因克隆中沒有什么實用價值。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達93%。

II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實際上，從已知的情況上看，這些酶很可能是在進化過程中各自獨立產(chǎn)生的，而非來源于同一個祖先。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

基本特性1、一般性狀最適pH為6～8；

NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巰基有保護作用，對熱不穩(wěn)定，通常是溶于含有50％甘油的緩沖液中貯存于–20℃環(huán)境下，取出使用時必須立即置于冰浴中。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

II型限制性內(nèi)切酶的基本特性2、識別序列

多數(shù)限制酶的識別序列為回文對稱序列（上海自來水來自海上），通常的識別序列是4bp～6bp，有些則為7bp～8bp，甚或多于8bp，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。切割位置因酶而異，有些是隔開的；常在識別序列內(nèi)或其附近水解DNA鏈中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生帶3‘-羥基和5’-磷酸基團的DNA產(chǎn)物。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

基本特性2、識別序列識別位點有些是連續(xù)的：EcoRIG↓AATTC。有些是不連續(xù)的：SatIGC↓NGC

識別位點的共同特征是具有回文結(jié)構(gòu)，即雙重螺旋對稱的結(jié)構(gòu)形式

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)2、識別序列

和類型I酶相同，類型II酶只對2條鏈都沒有甲基化的DNA進行切割，對1條鏈甲基化的使另一條鏈甲基化，

2條鏈都甲基化的不發(fā)生作用。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性3、酶切切口

有些酶在識別序列內(nèi)的對稱軸上切割，其切割產(chǎn)物具平頭末端；

SmaICCC↓GGGGGG↑CCC

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性3、酶切切口

很多限制酶不能精確地在2個對稱軸部位切割，而在識別序列2條鏈對應(yīng)位上錯位切割，切割產(chǎn)物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些為3’-突出的粘性末端。

EcoRI位點G↓AATTCCTTAA↑G

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)基本特性（4）限制片斷末端的連接作用分為：分子間連接和分子內(nèi)連接許多種限制酶切割DNA分子形成的短片斷能夠自發(fā)的重新環(huán)化起來，環(huán)化分子加熱后又會重新線性化。但是，如果馬上使用連接酶處理，使他們的3-OH基團和5-P基團之間封閉起來，環(huán)化就是永久的了。酶切形成的粘性末端任何一側(cè)都能和另一末端互補配對，使任何含有該識別序列的DNA分子都能和另一個含相同識別序列的DNA分子容易地連接成新的重組分子（4）限制片斷末端的連接作用5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’（4）限制片斷末端的連接作用

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)可以分為三種第一種，在識別序列中進行切割的酶

最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI，這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要部分。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個氨基酸左右，大部分都以同源二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識別的是對稱序列。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

該系統(tǒng)可以分為三種第一種，在識別序列中進行切割的酶但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識別非對稱序列。一些酶識別連續(xù)的序列（如EcoRI識別GAATTC）；而另一些識別不連續(xù)的序列（如BglI識別GCCNNNNNGGC）。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個3’羥基端和一個5’磷酸基團。它們的活性要求鎂離子，而相應(yīng)的修飾酶則需要S-甲硫氨酸腺苷（SAM）的存在。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第二種，IIs型（移動切割限制酶）

比較常見，占5%，具有輔因子要求，比如FokI和AlwI。這些酶的大小居中，約為400-650個氨基酸左右，有一個結(jié)合識別位點的域和一個專門切割DNA的功能域。一般認為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開DNA鏈。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)第二種，IIs型（移動切割限制酶）其識別位點是連續(xù)的非對稱序列，長度為4-7bp，在識別位點之外切開DNA，切割位點可能在識別位點一側(cè)的20bp范圍內(nèi)。

因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)第二種，IIs型（移動切割限制酶）

1）具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)，即其識別位點是連續(xù)的非對稱序列，長度為4-7bp。

2）酶切位點與識別位點不一致，切點常在識別位點的一側(cè)，1--20bp。因此一些IIS型的酶在切割有多個識別位點的DNA分子時，活性可能更高。3）酶切后的末端經(jīng)補平后又可發(fā)生酶切反應(yīng)。4）產(chǎn)生粘性末端可以是1--5個核苷酸。5）均為單體，分子量為47—108kD。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第三種，II型限制性內(nèi)切酶（有時也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶）是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個堿基組成，在同一條多肽鏈上同時具有限制和修飾酶活性。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們在N端由一個負責(zé)切開DNA的功能域，這個域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個識別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開底物，或作為修飾酶將其甲基化。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

第三種，II型限制性內(nèi)切酶有些酶識別連續(xù)序列，并在識別位點的一端切開DNA鏈；而另一些酶識別不連續(xù)的序列（如BcgI：CGANNNNNNTGC），并在識別位點的兩端切開DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識別序列的片段。表4-3一些類型II限制性內(nèi)切酶的識別位點和切割部位限制性內(nèi)切酶作用位點和切割部位限制性內(nèi)切酶作用位點和切割部位BamHI(5’)G↓GATCC(3’)CCTAG↑GHind

III(5’)A↓AGCTT(3’)TTCGA↑AClaI(5’)AT↓CGAT(3’)TAGC↑TANotI(5’)GC↓GGCCGC(3’)CGCCGG↑CGEcoRI(5’)G↓AATTC(3’)CTTAA↑GPstI(5’)CTGC↓AG(3’)GA↑CGTCEcoRV(5’)GAT↓ATC(3’)CTA↑TAGPvuII(5’)CAG↓CTG(3’)GTC↑GAC圖4-3限制性內(nèi)切酶的作用

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

Ⅱ型限制酶一般是同源二聚體（homodimer），由兩個彼此按相反方向結(jié)合在一起的相同亞單位組成，每個亞單位作用在DNA鏈的兩個互補位點上。修飾酶是單體，修飾作用一般由兩個甲基轉(zhuǎn)移酶來完成，分別作用于其中一條鏈，但甲基化的堿基在兩條鏈上是不同的。

在Ⅱ型限制酶中還有一類特殊的類型，該酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，造成一個切口，這類限制酶也稱切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBI

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)所占的比例最大，達93%。Ⅱ型酶相對來說最簡單，它們識別回文對稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割DNA，產(chǎn)生帶3‘-羥基和5’-磷酸基團的DNA產(chǎn)物，需Mg2+的存在才能發(fā)揮活性，相應(yīng)的修飾酶只需SAM。識別序列主要為4-6bp，或更長且呈二重對稱的特殊序列，但有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列，切割位置因酶而異，有些是隔開的。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅱ型（typeⅡ）限制與修飾系統(tǒng)

在其識別位點之中或臨近的確定位點特異地切開DNA鏈，特異性最強，產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類，在基因工程中大量使用，是基因工程中主要的限制酶。

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

Ⅲ型（typeⅢ）限制與修飾系統(tǒng)限制與修飾系統(tǒng)的種類更少，所占比例不到1%。

是兼有限制-修飾兩種功能的雙亞基酶，M亞基負責(zé)識別與修飾，R亞基負責(zé)切割。它們在識別序列下游24～26bp處切開DNA鏈，并且要求識別位點是反向重復(fù)序列。特異性比較差，很少能產(chǎn)生完全切割的片段，因而不具備實用價值，也沒有人將其商業(yè)化。如EcoP1和EcoP15，它們的識別位點分別是AGACC和CAGCAG，切割位點則在下游24-26bp處比較內(nèi)容

ⅠⅡⅢ酶分子三亞基雙功能酶內(nèi)切酶與甲基化酶分子不在一起二亞基雙功能酶識別位點二分非對稱4-6bp,大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)5-7bp非對稱切割位點無特異性，至少在識別位點外1000bp在識別位點中或靠近識別位點在識別位點下游24-26bp限制反應(yīng)與甲基化反應(yīng)互斥分開的反應(yīng)同時競爭限制作用是否需用ATPYesNoYes

表4－4各種限制與修飾系統(tǒng)的比較

一、限制與修飾

4．限制與修飾系統(tǒng)的種類

I類：不適用于基因工程。只在腸道菌中發(fā)現(xiàn)。Ⅱ類：基因工程的工具酶。Ⅲ類：切割位點不在識別位點，一般離識別位點25bp～27bp，對分子克隆操作亦無實用意義。

在基因操作中，一般所說的限制酶或修飾酶，除非特指，均指Ⅱ型系統(tǒng)中的種類。

一、限制與修飾

5．限制酶發(fā)現(xiàn)與鑒定的現(xiàn)狀

從大小上來說，它們限制性內(nèi)切酶可以小到如PvuII（157個氨基酸），也可以比1250個氨基酸的CjeI更大。

1986年下半年發(fā)現(xiàn)615種限制酶和98種甲基化酶；1998年發(fā)現(xiàn)10000種細菌或古細菌中存在3000種酶，且酶有200多種特異性。到2005年1月，共發(fā)現(xiàn)4342種限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681種，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有59、3612、10種，甲基化指導(dǎo)的限制酶有3種，商業(yè)化的限制酶有588種，在Ⅱ型限制酶中共有221種特異性。

二、限制酶識別的序列

1．限制酶識別序列的長度

限制酶識別序列的長度一般為4-8個堿基，最常見的為6個堿基（表4－3）。當(dāng)識別序列為4個和6個堿基時，它們可識別的序列在完全隨機的情況下，平均每256個和4096個堿基中會出現(xiàn)一個識別位點（44=256，46=4096）。

以下是幾個有代表性的種類，箭頭指切割位置。

4個堿基識別位點：Sau3AⅠ↓GATC

5個堿基識別位點：EcoRⅡ↓CCWGG

NciⅠCC↓SGG

6個堿基識別位點：EcoRⅠG↓AATTC

HindⅢ

A↓AGCTT

7個堿基識別位點：BbvCⅠ

CC↓TCAGC

PpuMⅠ

RG↓GWCCY

8個堿基識別位點：NotⅠ

GC↓GGCCGC

SfiⅠGGCCNNNN↓NGGCC

以上序列中部分字母代表的堿基如下。

R=A或GY=C或TM=A或C

K=G或TS=C或GW=A或T

H=A或C或TB=C或G或TV=A或C或G

D=A或G或TN=A或C或G或TNNNNNNNNNNNNGGATTCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）電泳

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-CAATTG-5’EcoRⅠ的識別序列HaeⅠ的識別序列5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的識別序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的識別序列和酶切切口（平端）二、限制酶識別的序列2．限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)

限制酶識別的序列大多數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)，切割位點在DNA兩條鏈相對稱的位置。

EcoRⅠ和HindⅢ的識別序列和切割位置如下。

EcoRⅠG↓AATTCHindⅢA↓AGCTT

CTTAA↑GTTCGA↑A

二、限制酶識別的序列2．限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶的識別序列不是對稱的，如

AccBSⅠ[CCGCTC（-3/-3）]和

BssSⅠ[CTCGTG（-5/-1）]，識別序列后面括號內(nèi)的數(shù)字表示在兩條鏈上的切割位置。

AccBSⅠCCG↓CTCBssSⅠC↓TCGTG

GGC↑GAGGAGCA↑C二、限制酶識別的序列2．限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶可識別多種序列，如

AccⅠ識別的序列是GT↓MKAC，也就是說可識別4種序列，其中兩種是對稱的，另兩種是非對稱的。

HindⅡ識別的序列是GTY↓RAC。二、限制酶識別的序列2．限制酶識別序列的結(jié)構(gòu)

有一些限制酶識別的序列呈間斷對稱，對稱序列之間含有若干個任意堿基。如

AlwNⅠ和DdeⅠ，它們的識別序列如下。

AlwNⅠCAGNNNC↓TGDdeⅠC↓TNAG

GT↑CNNNGACGANT↑C二、限制酶識別的序列3．限制酶切割的位置

限制酶對DNA的切割位置大多數(shù)在內(nèi)部，但也有在外部的。在外部的，又有兩端、兩側(cè)和單側(cè)之別。

切點在兩端的有

Sau3AⅠ（↓GATC）、NlaⅢ（CATG↓）和

EcoRⅡ（↓CCWGG）等；二、限制酶識別的序列3．限制酶切割的位置

在兩側(cè)的有BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和

TspRⅠ（CASTGNN↓），

BcgⅠ酶的切割特性與其它酶不同，它們在識別位點的兩端各切開一個斷點，而不是只產(chǎn)生一個斷點。

BcgⅠ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓TspRⅠNNCAC（G）TGNN↓

↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑

↑NNGTG（C）ACNN

切點在識別位點外側(cè)的還有BbvⅠ[GCAGC（8/12）]和

BspMⅠ[ACCTGC（4/8）]等。表4－5內(nèi)切酶為4，6bp回文結(jié)構(gòu)的識別序列和酶切位點

三、限制酶產(chǎn)生的末端

1．限制酶產(chǎn)生匹配粘端（matchedends）

識別位點為回文對稱結(jié)構(gòu)的序列經(jīng)限制酶切割后，產(chǎn)生的末端為匹配粘端，亦即粘性末端（cohesiveend），這樣形成的兩個末端是相同的，也是互補的。若在對稱軸5'側(cè)切割底物，DNA雙鏈交錯斷開產(chǎn)生5'突出粘性末端，如

EcoRⅠ；若在3'-側(cè)切割，則產(chǎn)生3'突出粘性末端，如

KpnⅠ。

EcoRⅠ

5

NNG↓AATTCNN

3

3NNCTTAA↑GNN5三、限制酶產(chǎn)生的末端

2．限制酶產(chǎn)生平末端（Bluntend）

在回文對稱軸上同時切割DNA的兩條鏈，則產(chǎn)生平末端，如HaeⅢ（GG↓CC）和EcoRV（GAT↓ATC）。產(chǎn)生平末端的DNA可任意連接，但連接效率較粘性末端低。三、限制酶產(chǎn)生的末端

3．限制酶產(chǎn)生非對稱突出端

許多限制酶切割DNA產(chǎn)生非對稱突出端。

當(dāng)識別序列為非對稱序列時，切割的DNA產(chǎn)物的末端是不同的，如

BbvCⅠ的識別切割位點如下。

CC↓TCAGC

GGAGT↑CG

三、限制酶產(chǎn)生的末端

3．限制酶產(chǎn)生非對稱突出端

有些限制酶識別簡并序列，其識別的序列中有幾種是非對稱的。如

AccⅠ，它的識別切割位點如下，其中GTAGAC和GTCTAC為非對稱。

GT↓AT/CGAC

CATA/GC↑TG

有些限制酶識別間隔序列，間隔區(qū)域的序列是任意的，如DraⅢ和

EarⅠ，它們的識別切割位點分別是CAC↑NNN↓GTG和CTCTTC（1/4）。三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些來源不同但識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。具體可分為：

①同序同切酶

這些酶識別序列和切割位置都相同，如HindⅡ與

HincⅡ識別切割位點為GTY↓RAC，

HpaⅡ與HapⅡ識別切割位點為C↓CGG，

MobⅠ與

Sau3AⅠ識別切割位點為↓GATC。三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

是指一些來源不同但識別相同序列的限制酶稱同裂酶，但它們的切割位點可能不同。具體可分為：

②同序異切酶

KpnⅠ和

Acc65Ⅰ識別的序列是相同的，但它們的切割位點不同，分別為GGTAC↓C和G↓GTACC。另外，Asp718Ⅰ識別和切割位點為G↓GTACC。

三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

③“同功多位”許多識別簡并序列的限制酶包含了另一種限制酶的功能。如EcoRⅠ識別和切割位點為G↓AATTC，ApoⅠ識別和切割位點為R↓AATTY，后者可識別前者的序列。另外，

HpaⅠ和HincⅡ的識別位點也有交叉，它們的識別和切割位點分別為GTT↓AAC和

HincⅡ。

三、限制酶產(chǎn)生的末端

4．同裂酶（isoschizomer）

④其它有些限制酶識別的序列有交叉，如在pUC系列質(zhì)粒的多克隆位點中有一個

SalⅠ位點（識別切割位點為G↓TCGAC），該位點也可被AccⅠ（識別切割位點為GT↓MKAC）和HincⅡ（識別切割位點為GTY↓RAC）切割。三、限制酶產(chǎn)生的末端

5．同尾酶

來源各異，識別的靶序列也各不相同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端，且是對稱的，這些限制酶統(tǒng)稱為同尾酶。這些酶切割DNA得到的產(chǎn)物可進行粘端連接。如：·

EcoRⅠ

G↓AATCCMfeⅠ

C↓AATTCApoⅠR↓AATTY

·SpeⅠA↓CTAGT

NheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGA·BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATC

StyⅠC↓CWWGG

·ClaⅠAT↓CGAT

AccⅠ

GT↓MKAC（pUC19）三、限制酶產(chǎn)生的末端

6．識別特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

有些線粒體、葉綠體、核DNA、T偶數(shù)噬菌體含有一些編碼內(nèi)切酶的內(nèi)含子，有些intein（proteinsplicingelement）也有內(nèi)切酶的活性，這兩類內(nèi)切核酸酶稱為I-prefix和pI-prefix系列內(nèi)切酶，它們識別的序列很長。

I-prefix是由在RNA水平上剪切和編碼的，pI-prefix在蛋白質(zhì)水平上剪切的產(chǎn)物，這類內(nèi)切酶也稱為homingendonuclease，目前商業(yè)化的種類有6種。三、限制酶產(chǎn)生的末端

6．識別特殊系列的I-prefix和pI-prefix系列酶

從因特網(wǎng)上可以找到Intein的數(shù)據(jù)庫Inbase（InteinDatabase），該網(wǎng)站由NewEnglandBioLabs公司維護（）。三、限制酶產(chǎn)生的末端

7．其他限制性內(nèi)切酶

I-CeuI酶是衣滴蟲（Chlamydomonaseugametos）葉綠體大rRNA基因的內(nèi)含子編碼的產(chǎn)物，識別位點為26bp，識別的核心部位為-12至+7位置的19bp。反應(yīng)溫度為37℃，識別位點如下，方框內(nèi)為核心識別序列：TAACTATAACGGTC↑CTAA↓GGCA四、DNA末端長度對限制酶切割的影響

限制酶切割DNA時對識別序列兩端的非識別序列有長度的要求，也就是說在識別序列兩端必須有一定數(shù)量的核苷酸，否則限制酶將難以發(fā)揮切割活性。

用20單位（Units）限制酶切割1

g標(biāo)記的寡核苷酸做測試時，發(fā)現(xiàn)不同的酶對識別序列兩端的長度有不同的要求。

EcoRⅠ對兩端的序列長度要求較小，在識別序列外側(cè)有一個堿基對時在2小時的切割活性可達90%。而

AccⅠ和HindⅢ對兩端的序列長度要求較大。表4－5靠近DNA片段末端的切割效率%（用寡核苷酸檢測）限制酶待測的寡核苷酸序列待測的寡核苷酸序列2hr20hrAccⅠCCGGTCGACCGG00HindⅢCAAGCTTG

CCAAGCTTGG

CCCAAGCTTGGG0

0

100

0

75EcoRⅠGGAATTCC>90>90PstⅠ

GCTGCAGC

TGCACTGCAGTGCA

AACTGCAG（N）14

CTGCAG（N）200

10

>90

00

10

>90

0四、DNA末端長度對限制酶切割的影響

用DNA片段（線性載體）檢測末端長度對切割的影響時，同樣發(fā)現(xiàn)識別序列的末端長度對酶切效率有明顯影響，不同的酶對末端長度的要求是不同。

在設(shè)計PCR引物時，如果要在末端引入一個酶切位點，為保證能夠順利切割擴增的PCR產(chǎn)物，應(yīng)在設(shè)計的引物末端加上能夠滿足要求的堿基數(shù)目。另外，了解末端長度對切割的影響還可幫助在雙酶切多克隆位點時選擇酶切秩序。五、位點偏愛（Sitepreference）

某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點表現(xiàn)出偏愛性切割，即對不同位置的同一個識別序列表現(xiàn)出不同的切割效率的現(xiàn)象稱作位點偏愛。五、位點偏愛（Sitepreference）某些噬菌體DNA中的某些相同的酶切位點對酶的敏感性是不同。λ噬菌體DNA為48502bp，含12bp粘端。

EcoRⅠ酶切割

噬菌體中的5個位點時并不是隨機的，靠近右端的位點比分子中間的位點切割快10倍；EcoRⅠ對腺病毒2（adenvirus-2）DNA不同位置切點的切割速率也不同。

EcoRⅠ和HindⅢ在

噬菌體DNA中的切割速率分別有10倍和14倍的差異。五、位點偏愛（Sitepreference）

噬菌體DNA有4個SacⅡ位點，三個在中央，一個在右臂，對中央三個位點的酶切速度快50倍。在φX174噬菌體（單鏈環(huán)狀，5386bp，DNA復(fù)制時可以雙鏈形式存在）DNA中發(fā)現(xiàn)

HgaⅠ切割某些位點比其它的快。在腺病毒2中，CTCGAG位點對

PaeR7Ⅰ完全抵抗，但同裂酶

XhoⅠ卻很易切割，原因是5'末端有一個CT二核苷酸，與甲基化完全無關(guān)。五、位點偏愛（Sitepreference）造成上述現(xiàn)象的原因有以下幾種情況：

NarⅠ，NaeⅠ和SacⅡ三種酶屬于在切割DNA之前需要同時與兩個識別位點作用的一類酶。

BspMⅠ、EcoRⅡ和HpaⅡ則屬另一種情況，它們對要求作用的DNA序列上有兩個明顯不同的結(jié)合位點，其中一個是為DNA切割激活另一個的變構(gòu)位點（allosteric）。這兩序列可由順式（cis）方式提供，即相互靠近或形成環(huán)（loop）；或由反式（trans）方式提供，其變構(gòu)位點由含識別序列的寡核苷酸提供。

六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

常規(guī)緩沖液一般包括提供穩(wěn)定pH值的緩沖劑、Mg++、DTT（二硫蘇糖醇）以及BSA（小牛血請白蛋白）。

pH經(jīng)常為7.0-7.9（在25℃時），用Tris-HCl或乙酸調(diào)節(jié)；

Mg++

作為酶的活性中心，由MgCl2

和MgAc提供，濃度常為10mM；

DTT濃度常為1mM。有時緩沖液中還要加入100

g/mlBSA，但只是少數(shù)反應(yīng)需要。

六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

不同的酶對離子強度的要求差異很大，并依次將限制酶緩沖液按離子強度的差異分為高、中、低三種類型，離子強度以NaCl來滿足，濃度分別為100mM、50mM和0mM。六、酶切反應(yīng)條件

1．緩沖液

要對DNA進行雙酶切時，如何選擇緩沖液是相當(dāng)重要的。一方面可選用都合適的緩沖液或通用緩沖液；若找不到共用的緩沖液則先用低濃度的，再加適量NaCl和第二種酶；或先用低鹽緩沖液再用高鹽緩沖液（DNA可純化或不純化）

六、酶切反應(yīng)條件

2．反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度大多數(shù)為37℃，一部分為50-65℃，少數(shù)25-30℃。高溫作用酶在37℃下的活性會下降，多數(shù)僅為最適條件下的10-50%。如Taq

限制酶（正常反應(yīng)溫度為65℃），在37℃只有在65℃活性的10%；

ApoⅠ（正常反應(yīng)溫度為50℃），37℃只有在50℃時活性的50%。銷售商在產(chǎn)品說明中都會標(biāo)明最佳反應(yīng)溫度。

六、酶切反應(yīng)條件

3．反應(yīng)時間

反應(yīng)時間通常為1小時或更多，許多酶延長反應(yīng)時間可減少酶的用量。

EcoRⅠ反應(yīng)時間為16小時，則所用酶量為只切1小時的1/8。其它一些酶也有類似情況，如HindⅢ為1/8；KpnⅠ為1/4；BamHⅠ為1/2。

六、酶切反應(yīng)條件

4．終止酶切的方法

EDTA可鏊合鎂離子，從而可終止酶切反應(yīng)，終止?jié)舛葹?0mM；加熱是常用的方法，對于最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶，在65℃或80℃處理20分鐘可使酶活性大部分喪失。但是對于在80℃作用20分鐘也有不失活的酶，如最佳反應(yīng)溫度為37℃的酶

BglⅡ、HpaⅠ和PvuⅡ，65℃酶

Tth111Ⅰ和

TspRⅠ，以及50℃酶

Bc1Ⅰ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用試劑盒純化DNA。

七、星星活性（staractivity）

1、定義

在極端非標(biāo)準條件下，限制酶能切割與識別序列相似的序列，這個改變的特殊性稱星星活性。實際上星星活性是限制性內(nèi)切酶的一般性質(zhì)，任何一種限制酶在極端非標(biāo)準條件下都能切割非典型位點，如

ApoI（2）、AseI（2）、BamHI（3）、BssHII（2）、EcoRI（4）、EcoRV（5）、HindIII（1）、HinfI（6、7）、PstI（8）、PvuII（9）、SalI（8）、ScaI（2）、TaqI（10）、XmnI（2）、KpnⅠ等酶皆可表現(xiàn)出星星活性。

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號活性的因素

酶識別特異性的改變受酶本身的性質(zhì)及可能引起星號活性的反應(yīng)條件影響，常見的引起酶識別改變的條件有：

單堿基替換－1個堿基的變化；

識別序列外側(cè)堿基縮短－識別位點外層堿基的隨意性

單鏈切刻－單鏈缺口

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號活性的因素較高的甘油濃度（>5%v/v）；酶與底物DNA比例過高（不同的酶情況不同，通常為>100U/

l

）；

離子強度低，即低鹽濃度（<25mM）高pH值（>pH8.0）存在有機溶劑（如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）用其他二價離子替代鎂離子,如Mn2+、Cu2+

、Co2+、Zn2＋等。

七、星星活性（staractivity）

2、導(dǎo)致星號活性的因素以上因素的影響程度因酶的不同而有所不同，如EcoRI比PstI對甘油濃度更敏感，而后者則對高pH值更敏感一些。

Polisky等對EcoRI的早期研究表明，在低鹽濃度、高pH值條件下，EcoRI可能切割N/AATTN序列；最近，Gardner等的研究表明，只要識別中心的四堿基序列（AATT）不出現(xiàn)A/T替換，EcoRI可以切割其它任何單堿基替代序列。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星號活性的方法星星活性在絕大多數(shù)情況下是可控制的盡量用較少的酶進行完全消化反應(yīng)，這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。盡量避免有機溶劑（如制備DNA時引入的乙醇）的污染。將離子濃度提高到100-150mM（若酶活性不受離子強度影響）。將反應(yīng)緩沖液的pH值降到7.0。二價離子用Mg2+。

七、星星活性（staractivity）

3、抑制星號活性的方法大多數(shù)星號活性是可以控制的，只要在正常條件下使用隨酶提供的Buffer就不會出現(xiàn)星號活性。

八、單鏈DNA的切割

部分切割雙鏈DNA的酶也可消化其單鏈，但是切割效率不同。

HinPⅡ、HhaⅠ、MnlⅠ切割單鏈DNA的效率是切割雙鏈的50%

HaeⅢ切割單鏈DNA的效率是切割雙鏈的10%

BstNⅠ、DdeⅠ、HgaⅠ、HinfⅠ、TaqⅠ切割單鏈DNA的速度比切割雙鏈慢100倍。

八、單鏈DNA的切割

還有一些酶不切割單鏈DNA，如AluⅠ、BbvⅠ、DpnⅠ、FnuDⅡ、FokⅠ、HpaⅡ、HphⅠ、MobⅠ、MobⅡ、MspⅠ、Sau3AⅠ、SfaNⅠ等等。

有些限制酶只切割雙鏈DNA中的一條鏈，產(chǎn)生單鏈缺口，即切口酶（nickingenzyme），如N.BstNBⅠ。這類酶在命名時前面要加一個N，目前已經(jīng)商品化的這類酶共有7種。

N.BstNBⅠ的識別序列和切割位置如下：

5′...GAGTCNNNNN...3′

3′...CTCAGNNNNN...5′

九、酶切位點的引入

通過酶切和連接可產(chǎn)生新的酶切位點

（1）將產(chǎn)生的5‘突出端補平后，再連接可產(chǎn)生新的酶切位點

EcoRⅠ

的識別位點是GAATTC，先用它來切片段，將5'突出端補平后，再連接可產(chǎn)生

XmaⅠ（GAANNNNTTC）和AceⅠ（ATTAAT）酶切位點，而

EcoRⅠ的酶切位點消失。

……GAATTC……補平

….GAATTAATTC….

連接

….GAATTAATTC…

……CTTAAG……….CTTAATTAAG….….CTTAATTAAG…

對

HindⅢ位點（AAGCTT）來說，經(jīng)酶切和連接可產(chǎn)生

AluⅠ和NheⅠ酶切位點，同時

HindⅢ位點消失九、酶切位點的引入

（2）同尾末端的連接

不同的同尾酶切割DNA產(chǎn)生的末端再相互連接時，可產(chǎn)生新的酶切位點，同時原來的酶切位點卻消失如BamHⅠ（G↓AATCC）+BclⅠ（T↓GATCA）→

AlwⅠ（GGATC4/5）

XbaⅠ（T↓CTAGA）+AvrⅡ，或

NheⅠ或SpeⅠ或StyⅠ（CCTAGG）→

BfaⅠ（C↓TAG）也產(chǎn)生了新的酶切位點。九、酶切位點的引入

（3）平端連接平末端的限制酶切割的DNA在連接后也可產(chǎn)生新的酶切位點，如

PvuⅡ（CAGCTG）+EcoRV（GATATC）→

MobⅠ（GATC）。

十、影響酶活性的因素

影響酶切活性的因素有許多，概略的說可分為：外因：反應(yīng)條件、底物的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積的選擇以及反應(yīng)時間的長短等等。內(nèi)因：位點偏愛性、甲基化底物、底物的構(gòu)象。構(gòu)象的影響主要指切割線性DNA和超螺旋DNA時的活性，如與切割

DNA相比，EcoRⅠ、PstⅠ、SalⅠ需要至少2.5-10倍的酶來切割pBR322的超螺旋DNA。

PaeRTⅠ與XhoⅠ切割相同的序列（C↓TCGAG），但如果5‘端為CT則

PaeRTⅠ不能切割。十、影響酶活性的因素

1）DNA純度污染在DNA制劑中的某些物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、酚、酒精、異丙醇、EDTA、高鹽離子等會影響酶切。

克服方法：在純化過程中，空轉(zhuǎn)一定要時間充足、要徹底。用微堿的TE洗脫。提高限制內(nèi)切酶的用量。延長酶切時間擴大酶切體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)得稀釋。

十、影響酶活性的因素

2）DNA甲基化的程度識別序列中某些堿基甲基化后會阻礙酶活性通常從大腸桿菌細胞中分離的質(zhì)粒DNA，都混有特定核苷酸序列的甲基化酶：DAM甲基化酶：催化GATC序列中的腺嘌呤殘基甲基化dcm甲基化酶：催化cca\tgg序列中內(nèi)部的胞嘧啶殘基的甲基化。

所以在基因克隆中是使用了失去甲基化酶的大腸桿菌制備質(zhì)粒DNA。十、影響酶活性的因素

3）酶切消化反應(yīng)溫度酶切標(biāo)準溫度是37℃

，但是某些特殊的酶最適合溫度是例外的，比如SmaI是30℃

。過高或者過低的溫度會使內(nèi)切酶失去活性十、影響酶活性的因素

4）DNA的分子結(jié)構(gòu)

DNA分子的不同構(gòu)型對限制性內(nèi)切酶的活性也有很大的影響。當(dāng)DNA分子為線性的時候最容易，當(dāng)DNA分子存在二級結(jié)構(gòu)的時候，酶切的活力就會大大降低。十、影響酶活性的因素

5）限制性內(nèi)切酶的緩沖液緩沖液一般的組成部分包括：氯化鎂、Tris-HCl,β

－巰基乙醇或者DTT、BSA等。適合的二價金屬離子濃度，通常為Mg2＋。適合的pH通常為7.4左右。十一、酶切位點在基因組中分布的不均一性

在基因組中堿基對的排列是非均勻的，因此盡管有的酶切序列中GC含量相同，但在基因組中出現(xiàn)的機率還是不一樣。如在

E.coli中，

AsoⅠ（GGCGCGCC）切點平均20kb中出現(xiàn)一個

NotⅠ（GCGGCCGC）切點平均200kb中出現(xiàn)一個（常利用它出現(xiàn)的機會少來構(gòu)建圖譜）

EcoRⅠ

和HindⅢ切點平均5kb中出現(xiàn)一個

SpeⅠ（ACTAGT）切點平均60kb中出現(xiàn)一個。十二、限制性內(nèi)切酶的貯存與應(yīng)用

限制酶對熱不穩(wěn)定，貯存于-20oC，為避免反復(fù)凍溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用時添加相應(yīng)的緩沖液稀釋，降低反應(yīng)液中