基因工程的基本操作程序（第1課時）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

基因工程的基本操作程序年級：高二學(xué)科：生物學(xué)（人教版）背景：1992年，我國北方棉鈴蟲連年大暴發(fā)，減產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟損失，棉農(nóng)“談蟲色變”。原本種植期噴灑兩三次的農(nóng)藥，由于一遍遍打農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性，接連噴灑多次也不見效果，因施藥過量土壤受到極大污染，稻田無法正常耕種。1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，2015年我國100抗蟲棉新品種多個40減少農(nóng)藥容量萬噸450增收節(jié)支社會效益億元你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟？目的基因的篩選與獲取培育培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要步驟基因表達載體的構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定目的基因的篩選與獲取培育培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉主要步驟什么是目的基因？篩選與獲取目的基因方法有哪些？一、目的基因的篩選與獲取用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因1.目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因抗逆性基因生產(chǎn)藥物基因毒物降解基因工業(yè)用酶基因①定義非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動子終止子RNA聚合酶的結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄起始的信號編碼蛋白質(zhì)的合成終止RNA的合成②

基因的結(jié)構(gòu)原核生物的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)啟動子終止子外顯子內(nèi)含子真核生物的基因結(jié)構(gòu)②

基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄剪接外顯子內(nèi)含子前體mRNA成熟mRNA真核生物的基因結(jié)構(gòu)②

基因的結(jié)構(gòu)2.篩選合適的目的基因在浩瀚的“基因海洋”中找到所需要的目的基因往往不容易，從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。①明確目的基因已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因目的基因當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。Bt抗蟲蛋白只在某些昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體。因此Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。Bt基因Bt抗蟲蛋白編碼

蘇云金桿菌含有測序技術(shù)測定核酸和蛋白質(zhì)序列序列數(shù)據(jù)庫(如GenBank)以堿基順序或氨基酸殘基順序為基本內(nèi)容的分子生物信息數(shù)據(jù)庫序列對比工具(如BLAST)把感興趣的序列跟已經(jīng)存在的序列數(shù)據(jù)庫進行比較的工具。通過比對識別相關(guān)的序列，從而能獲得目的基因和蛋白質(zhì)的功能Q：明確了目的基因后，該怎么獲得它呢？②篩選目的基因的技術(shù)手段2.篩選合適的目的基因我國首批具有較高抗蟲活性的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，科學(xué)家人工合成了目的基因。DNA合成儀①人工合成法在已知目的基因核苷酸序列且基因較小的情況下，利用DNA合成儀自動合成。3.

獲取目的基因的方法根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復(fù)制的技術(shù)。原理②PCR擴增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）常用方法PCR儀3.

獲取目的基因的方法(1)原理：半保留復(fù)制(2)條件：⑥緩沖液②DNA模板⑤2種引物③4種脫氧核苷酸④耐高溫的DNA聚合酶①高溫(替代解旋酶)②PCR擴增（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）2種引物短單鏈核酸(DNA或RNA)

本質(zhì)：作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸

引物連接模板鏈的3’端

游離的脫氧核苷酸連接在引物的3’端

注意：1種引物會導(dǎo)致引物與引物之間結(jié)合形成雙鏈，不能與模板鏈結(jié)合。-3′5′-3′--5′子鏈延伸-5′3′-5′--3′子鏈延伸PCR的過程4種脫氧核苷酸引物耐高溫的DNA聚合酶DNA模板第①步：變性當(dāng)溫度超過90℃時，雙鏈DNA解旋為單鏈。第②步：復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。PCR的過程第③步：延伸當(dāng)溫度上升到72℃時，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。3′5′5′3′PCR的過程3′5′3′5′5′3′5′3′5′3′第1輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物。PCR的過程3′5′3′5′5′3′5′3′5′3′第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪循環(huán)的產(chǎn)物。PCR的過程模板DNA目的基因3′5′5′3′引物1引物2原料Taq聚合酶507295℃PCR三輪擴增過程目的基因3′5′5′3′507295℃第一輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第一輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第一輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第一輪：低溫復(fù)性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第一輪：中溫延伸PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第二輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第二輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第二輪：低溫復(fù)性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第二輪：中溫延伸PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第三輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第三輪：高溫變性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第三輪：低溫復(fù)性PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第三輪：中溫延伸PCR三輪擴增過程3′5′5′3′507295℃第三輪：中溫延伸PCR三輪擴增過程PCR小結(jié)①過程變性目的基因DNA受熱變性后解為單鏈復(fù)性2種引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合延伸以DNA單鏈為模板，在耐高溫的DNA聚合酶作用下延伸。即將4種脫氧核苷酸加到引物的3’端1個模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以指數(shù)形式擴增，可以擴增出約2n個DNA片段。②結(jié)果：(超過90℃)(50℃左右)(72℃左右)③PCR技術(shù)獲取目的基因時至少要經(jīng)過3次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因④經(jīng)過n輪復(fù)制，需要引物

個只有兩條母鏈上沒有引物2n+1-2⑤常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR產(chǎn)物比較項目細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化邊解旋邊復(fù)制DNA在高溫下變性解旋全部解旋后在復(fù)制場所主要在細(xì)胞核內(nèi)細(xì)胞外（主要在PCR擴增儀內(nèi)）酶解旋酶、DNA聚合酶等耐高溫的DNA聚合酶溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件控制溫度，需在不同溫度下進行結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板②

原料：均為四種脫氧核苷酸③

酶：均需DNA聚合酶④

引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端合成子鏈將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。4.通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因

基因組文庫部分基因文庫基因文庫①基因組文庫基因文庫就像一座圖書館，每一個基因就是一本書。如果一座“圖書館”中包含了一種生物所有的基因，那么，我們就可以說這個基因文庫很大，就像國家圖書館，這種基因文庫叫做基因組文庫。一種生物的一部分基因叫做部分基因文庫國家圖書館（基因組文庫）部分基因文庫一種生物的全部基因叫做基因組文庫。4.通過構(gòu)建基因文庫獲取目的基因

一種生物的一部分基因叫做部分基因文庫國家圖書館（基因組文庫）部分基因文庫一種生物的全部基因叫做基因組文庫。有一些基因文庫比較小，就像某個市或某個單位的圖書館，只包含一種生物的一部分基因，這種基因文