犬呼吸道癥候群病原分子診斷重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法

1犬呼吸道癥候群病原分子快速診斷重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法本文件規(guī)定犬呼吸道癥候群重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法(GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3.1犬瘟熱病毒：caninedistempervir犬瘟熱病毒屬于泛嗜性麻疹病毒(Pantropicmorbillivirus3.2犬流感病毒：canineinfluenzavirus,CIV犬流感病毒屬于正黏病毒科和A型流感病毒（InfluenzaAvirus,IAV）屬，是一種單股負(fù)鏈RNA病毒，對(duì)家犬及其他全科類動(dòng)物具有高度傳染性，可引3.3犬副流感病毒：Canineparainfluenzaviru犬副流感病毒在分類上屬副粘病毒科中n型副流感病毒亞型，主要引起犬的卡他性鼻炎和支氣3.4犬支原體：caninemycoplas3.5犬波氏桿菌：bordetellabronchisept犬波氏桿菌，是博德特氏菌屬(Bordetella)的一種小型革蘭管炎，表現(xiàn)為流鼻涕、打噴嚏咳嗽呼吸急促等3.6犬腺狀病毒：canineadenovir犬腺狀病毒屬于乳腺病毒屬(Mastadenovirus)和腺病毒科(Adenoviridae)，是導(dǎo)致犬傳染性肝炎的最3.7酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，邊轉(zhuǎn)錄邊形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。利用熒光探針的標(biāo)記，隨著RAA反應(yīng)的進(jìn)行，RAA產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長(zhǎng)呈3.8一種重組酶介導(dǎo)鏈替換的恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)(簡(jiǎn)稱RT-RAA技術(shù))。利用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重組酶可與引物緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，在單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的作用下，邊轉(zhuǎn)錄邊形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。利用熒光探針的標(biāo)記，隨著RAA反應(yīng)的進(jìn)行，RAA產(chǎn)3.93.104符號(hào)和縮略語3A——260nm處的吸光值N——核酸稀釋倍數(shù)BS-RecA：枯草芽孢桿菌重組酶(Bacillussubtilisrecombinase)Bsu：枯草芽孢桿菌(BacillussubDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）RNA：核糖核酸（ribonuleicacid）RT-RAA：反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Reversetranscription-recombinase-aidamplificaSC-RecA：天藍(lán)色鏈霉菌重組酶（Streptomyce參照NY/T541—2016中6.12眼部組織和和分泌物樣品、6.19呼吸道犬腺病毒特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RAA/RT-RAA擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光的增幅情況，實(shí)現(xiàn)對(duì)犬呼犬流感病毒實(shí)時(shí)RAA熒光檢測(cè)所用的引物探針參見犬副流感病毒實(shí)時(shí)RAA熒光檢測(cè)所用的引物探針參犬支原體實(shí)時(shí)RAA熒光檢測(cè)所用的引物探針參犬腺病毒實(shí)時(shí)RAA熒光檢測(cè)所用的引物探針參Na?EDTA。7.2酚：氯仿：異戊醇=25：24：17.5TE緩沖液(pH8.0)：10mmol/LTr7.7RT-RAA擴(kuò)增體系：2.5mmol/LdNTP逆轉(zhuǎn)錄酶，250mmol/LTricine，12.5mmol/9.1核酸提取取臨床采樣的棉拭子樣本至一活凈的1.5mL離心管中,加入600mLCTAB提振蕩混勻后于70℃孵育15min,期間顛倒離心管2-3次；12000r/min離心5min,取上清液于一新的干凈1核酸提取也可采用等效提取試劑或市售商品化核酸提取試劑盒，按說明書進(jìn)行核酸提取即用或-80℃凍存?zhèn)溆谩?.2核酸濃度和純度的測(cè)定59.3.1RT-RAA擴(kuò)犬瘟熱病毒/犬流感病毒/犬副流感病毒實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光擴(kuò)增反應(yīng)總?cè)гw/犬波氏桿菌/犬腺病毒實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增反應(yīng)總體系見min,則判定被檢樣品陽性。12.1樣本陽性12.2樣本陰性RAA擴(kuò)增靈敏度高使得其容易污染導(dǎo)致假陽性，因此應(yīng)高度重視擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題，反應(yīng)過程檢測(cè)過程中防止交了污染的措施按照GB/T27401規(guī)7A.1犬瘟熱病毒RT-RAA引物序列及反應(yīng)參數(shù)名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬瘟熱病毒F:GTCGGGGAATTTAGAATGAACAAAATCTNR:CTAATCCAGCTTCCACAATGTAGTTATCTP:TATTGTTAGAAACAGGATTGCTGAGGACTFAM-dT(THF)BHQ1-dTCTTTGAGGCGATT-C3注：目的基因序列參見附錄B。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。A.2犬流感病毒RT-RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬流感病毒F:GCGATTTAAGTGATCCTCTCATTATTGCR:ACTCTGCTGTTCCTGCCGATACTCTTCCP:CACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTC[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TCTTCAAATGTAT-C3注：目的基因序列參見附錄D。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。A.3犬副流感病毒RT-RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬副流感病毒F:TCAAGAACTGCAAGATCAGAGTGAGGAAGGT220bpNR:ATGATTGAGCATTGTGGCTGATGGTAGCGAAAP:TTCTATTCTGCCTACGGATTGTTCTCAG[FAM-dT]A[THF]BHQ1-dTGGTGCAAGGGATT-C3注：目的基因序列參見附錄F。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬支原體F:AGAAGCACTTGCAGGAGATAACGCTGGATTEF-TuR:AATTCTGTGTGAGGGATAATTGAACCTGP:TGGATTATTACTTCGTGGAGTAAACCGTGAAGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TGAACGTGGACAAG-C3注：目的基因序列參見附錄F。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬波氏桿菌F:TAAGTCCGTCGCAAACCTGCCGTAATCC203bpflaAR:CGATTGGGACTTGTTCAGGTTGTTCTGGP:GCTGCCCGGTTTGAAGAAGCCTTTCTC[FAM-dT]C[THF][BHQ1-dT]GGGAGCCTCAACATGG-C3注：目的基因序列參見附錄D.5。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BQH-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長(zhǎng)度靶基因犬腺狀病毒F:CTCCGTCGATGCTGCCACAATGGTCTTAhexonR:CTTGTTGTCCAACTTAAAGTAAGAACTGGTTP:AGGACGCCGCCGAATACTTGTCTCCCGCCC[FAM-dT]G[THF][BHQ1]-dTTCAGTTTGCCCAA-C3注：目的基因序列參見附錄L。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。9C.1犬瘟熱病毒/犬流感病毒/犬副流感病毒實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光RT-RAA試劑體積/μL實(shí)時(shí)熒光RT-RAA擴(kuò)增體系（凍干粉）20啟動(dòng)劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板反應(yīng)總體系25C.2犬支原體/犬波氏桿菌/犬腺病毒實(shí)時(shí)熒光RAA試劑體積/μL實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增體系（凍干粉）20啟動(dòng)劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板反應(yīng)總體系25atactgcagccgactcggagatgagaaggtgggttaagtacacccaacagagacgtgtggtcggggaatttagaatgaacaaaatctggcttgatattacaggattgctgaggacttatctctgaggcggttcatggtagcacttatcttggatatcaaacgatccccagggaacaagcctagaattgctgaaatgatttgtgatatagataactacattgtggaagctggattagctagtttcatcttaactatcaaatttggcattgaaactatgtatccggctcttgggttgcatgagttttctggggagttaacaactattgaatcccttatgatgctatatcaacagatgggtgaaacagcaccgtacatggttattctggaaaattctgttcagaacaaatttagtgcaggatcctacccattgctctggagttatgccatgggtgttggtgttgaacttgaaaactccatgggagggttaaatttcggtagatcctactttgatccagcttatttcaggctcgggcaagagatggtcagaagatctgccggcaaagtgagctctgcacttgccgccgagcttggcatcaccaaggaagaggctcagctagtgtcagaaatagcatccaagacatggaggttgccaatcaggctaggcagatggtgcaagcaatgaggacaattgg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