(高清版)GBT 40642-2021 桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的檢測 高效液相色譜法

桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的檢測高效液相色譜法2021-10-11發(fā)布2022-05-01實(shí)施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由國家林業(yè)和草原局提出。本文件由全國林化產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC558)歸口。本文件起草單位：北京林業(yè)大學(xué)、深圳市品牌建設(shè)促進(jìn)中心、浙江圣氏生物科技有限公司、河北冠卓檢測科技股份有限公司、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院、中山洪力健康食品產(chǎn)業(yè)研究院、中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所、北京電子科技職業(yè)學(xué)院、中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所、無限極(中國)有限公司共同。1桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素的檢測高效液相色譜法1范圍本文件描述了采用高效液相色譜測定桑葉中1-脫氧野尻霉素含量的原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、檢測方法、結(jié)果計算與表示、重復(fù)性、精密度和加標(biāo)回收率。本文件適用于桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)是一種氨基酸衍生化試劑，主要適用于伯胺和仲胺的衍生化，反應(yīng)后的衍生物具有較強(qiáng)的紫外吸收，最大吸收波長為254nm。由于1-脫氧野尻霉素(DNJ)分子中有仲胺結(jié)構(gòu)，因此可以采用FMOC-Cl作為衍生化試劑對DNJ進(jìn)行衍生，利用HPLC對1-脫氧野尻霉素進(jìn)行定量檢測，檢測波長為254nm。DNJ與芴甲氧羰酰氯的反應(yīng)式見圖1。HClFMOC-ClDNJDNJ-FMOC圖1DNJ與芴甲氧羰酰氯的反應(yīng)式5試劑或材料除非另有說明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和符合GB/T6682一級的水。25.1試劑5.1.2冰乙酸(CH?COOH)。5.1.3芴甲氧酰羰氯(C?H?ClO?)。5.1.4甘氨酸(C?H?NO?)。5.2溶液配制芴甲氧酰氯FMOC-Cl乙腈溶液：稱取0.065gFMOC-Cl,精確至0.001g,用乙腈溶解，并定容至50mL,得到5mmol/L的FMOC-Cl乙腈溶液。FMOC-Cl乙腈溶液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。5.3標(biāo)準(zhǔn)品1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%。5.41-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液稱取100mg(精確至0.001g)1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，用0.01mol/L鹽酸水溶液溶解并定容至刻度線，混勻。5.51-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液將1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用鹽酸水溶液稀釋制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)液濃度分別為0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL、0.10mg/mL,臨用時配制。6儀器與設(shè)備6.1分析天平：靈敏度萬分之一克。6.2超聲振蕩器/超聲清洗器：超聲頻率40kHz～80kHz。6.3高效液相色譜儀：包含紫外檢測器或二極管檢測器、色譜工作站。6.4恒溫水浴鍋。7檢測方法7.1樣品處理稱取桑葉提取物0.100g試樣，精確至0.001g,用0.010mol/L鹽酸水溶液超聲輔助溶解15min,冷卻至室溫后，定容至50mL,得到試樣溶液。7.2衍生化反應(yīng)取標(biāo)準(zhǔn)品或試樣溶液100μL置于1.5mL的離心管中，依次加入0.4mol/L的硼酸鉀緩沖溶液(pH8.5)175μL和5mmol/L衍生化試劑FMOC-Cl乙腈溶液250μL,充分混合30s,在25℃恒溫水3浴下反應(yīng)25min,然后加入0.1mol/L甘氨酸溶液100μL用于中和過量的FMOC-Cl,反應(yīng)20min,再加入75μL體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸水溶液和300μL去離子水，待反應(yīng)結(jié)束后，用0.45μm有機(jī)相濾膜微濾，得到衍生后的樣品溶液。樣品溶液避光保存?zhèn)溆谩?.3測定條件按照制造商操作手冊運(yùn)行高效液相色譜儀；以下色譜分析條件可供參考，采用其他條件應(yīng)驗(yàn)證其適用性。色譜條件如下：——色譜柱：RP-C18(250mm×——流動相：乙腈-0.1%乙酸水溶液(32:68,體積比):——進(jìn)樣量：10μL;——檢測波長：254nm。7.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制按7.3色譜條件檢測，分別吸取不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液并按照7.2進(jìn)行衍生化反應(yīng)，吸取衍生后的樣品溶液10μL,進(jìn)樣于高效液相色譜儀，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的樣品溶液濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖參見附錄A。7.5試樣測定按7.3的色譜條件，取7.2步驟中衍生后的樣品溶液進(jìn)樣，得到試樣溶液的峰面積，根據(jù)保留時間和1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖定性。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得試樣溶液中1-脫氧野尻霉素的含量。試樣溶液中1-脫氧野尻霉素的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)將試樣溶液稀釋后測定或增加提取物的質(zhì)量重新檢測。8結(jié)果計算與表示8.1結(jié)果計算桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素含量按式(1)進(jìn)行計算：X——樣品中1-脫氧野尻霉素的含量，單位為毫克每克(mg/g);c——樣品中1-脫氧野尻霉素的濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);V——最終定容后樣品的體積，單位為毫升(mL);8.2結(jié)果表示計算結(jié)果以重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，保留至小數(shù)點(diǎn)后兩位有效數(shù)字。49重復(fù)性在重復(fù)條件下獲得的5次獨(dú)立測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。10精密度取同一試樣，連續(xù)進(jìn)樣5次，按7.3的色譜條件檢測其HPLC圖譜；比較1-脫氧野尻霉素對應(yīng)色譜峰的峰面積，5次進(jìn)樣的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不應(yīng)超過5%。11加標(biāo)回收率標(biāo)準(zhǔn)品添加量在待測樣品濃度0.5～1.5倍濃度范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率應(yīng)在90%～110%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%。5mAl