(高清版)GBT 40627-2021 油菜莖基潰瘍病菌活性檢測方法

油菜莖基潰瘍病菌活性檢測方法ViabilitytestofLeptosphaeriamaculans(Desm)Ces.etDeNot.2021-10-11發(fā)布2022-05-01實(shí)施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中華人民共和國深圳海關(guān)、深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院。1油菜莖基潰瘍病菌活性檢測方法本文件描述了應(yīng)用普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡對油菜莖基潰瘍病菌[Leptosphaeriamaculans(Desm.)Ces.etDeNot.]分生孢子進(jìn)行活性檢測的方法。本文件適用于油菜莖基潰瘍病菌相關(guān)寄主中攜帶的油菜莖基潰瘍病菌分生孢子的活性檢測鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。應(yīng)用熒光染料對油菜莖基潰瘍病菌分生孢子進(jìn)行染色處理，根據(jù)碘化丙啶(Propidiumlodide,PI)能夠穿透正在死亡或者已經(jīng)死亡的細(xì)胞膜，不能透過具有活力的細(xì)胞膜，使不具活性的孢子發(fā)出紅色熒光、具有活性的孢子不發(fā)出熒光的特點(diǎn)，運(yùn)用普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡對熒光染料處理的分生孢子進(jìn)行檢測，分析其活性情況。油菜莖基潰瘍病菌基本信息見附錄A。5儀器和試劑5.1試劑碘化丙啶(PI)溶液配置方法：稱取0.01gPI粉末，加入10mL無菌水，配制成濃度為1mg/mL的母液，置于棕色瓶4℃避光保存，使用前配制所需濃度。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):200g去皮土豆切成小方塊，加入1000mL自來水，煮沸15min,四層紗布過濾得到濾液，濾液中加入18g葡萄糖、18g瓊脂粉，加熱溶解后將溶液定容至1000mL,分裝到三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20min。5.2設(shè)備激光掃描共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡、高壓滅菌鍋、生物安全柜、生化培養(yǎng)箱、冰箱、離心機(jī)。6活性檢測方法6.1檢測樣品制備在超凈工作臺中，用解剖針將油菜莖基潰瘍病菌分生孢子挑到滅菌水中，充分振蕩3min,在顯微2鏡下檢測樣品濃度，確定稀釋比例，配制成終濃度為10個(gè)孢子/μL～100個(gè)孢子/μL的孢子懸浮液，鏡6.2孢子染色取199μL孢子懸浮液，加入1μL質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的PI染料，混勻，室溫下避光染色4min,染色完成后，16000g離心1min去上清液終止染色，加入滅菌去離子水洗滌一次，重新懸浮。避光放置備用。6.3普通熒光顯微鏡檢測吸取5μL活性染料處理之后的樣品制備玻片，封片，放置于普通熒光顯微鏡載物臺上，低倍鏡下找到孢子，轉(zhuǎn)到100倍油鏡下觀察，微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰。至少檢測30個(gè)孢子，觀察染色情況。PI染色檢測：將熒光光路打開，設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長534nm,收集熒光信號的發(fā)射波長617nm,收集熒光信號。微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰。染色結(jié)果參見附錄B。為了保證圖像能夠反映出孢子最真實(shí)的熒光染色情況，首先需要確認(rèn)明場通道下所得到孢子符合油菜莖基潰瘍病菌分生孢子形態(tài)特征，且圖像清晰。6.4激光掃描共聚焦顯微鏡檢測吸取5μL活性染料處理之后的樣品制備玻片，封片，置于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺上，低倍鏡下找到孢子，轉(zhuǎn)到100倍油鏡下觀察，微調(diào)至視野內(nèi)圖像清晰。選擇相應(yīng)的激光管(氬離子激光器)激發(fā)熒光信號，PI檢測設(shè)置熒光通道的激發(fā)波長(534nm),收集熒光信號的發(fā)射波長(617nm),并設(shè)置一個(gè)明場通道作為對照。選擇低像素掃描模式掃描(xy:512×512),重復(fù)掃描次數(shù)Average為1次，掃描速度Speed為9,根據(jù)成像效果調(diào)整探測針孔Pinhole、光電倍增管增益Gain和激光掃描強(qiáng)度ScanStr等參數(shù)，將圖像調(diào)整至質(zhì)量較好的效果。再用精確掃描方式(xy:2048×2048)根據(jù)信噪比調(diào)整掃描模式，選擇精確像素的平面掃描方式進(jìn)行粗略掃描(xy:2048×2048),重復(fù)掃描次數(shù)Average為2次，掃描速度Speed為6,獲取最終圖像。掃描至少30個(gè)孢子，觀察染色結(jié)果。為了保證圖像能夠反映出孢子最真實(shí)的熒光染色情況，首先需要確認(rèn)明場通道下所得到孢子符合油菜莖基潰瘍病菌分生孢子形態(tài)特征，且圖像清晰。6.5萌發(fā)試驗(yàn)取孢子懸浮液100μL,均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，用封口膜封口，置于25℃培養(yǎng)9h以上，觀察孢3子萌發(fā)情況，以芽管長度大于孢子本身長度視為萌發(fā)。7結(jié)果判斷與表述結(jié)果判斷與表述如下：——孢子染色后通過普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡隨機(jī)掃描至少30個(gè)孢子，所掃描的孢子中，所有孢子均無紅色熒光，判定油菜莖基潰瘍病菌孢子具有活性，參見附錄B;——孢子染色后通過普通熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡隨機(jī)掃描至少30個(gè)孢子，所掃描的孢子中，所有孢子均呈紅色熒光，判定油菜莖基潰瘍病菌孢子不具活性，參見附錄B;——激光掃描共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡掃描結(jié)果，存在少數(shù)分生孢子或個(gè)別分生孢子具有很弱的熒光，而無法判斷孢子活性的，則對未染色的孢子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)萌發(fā)情況判定，如萌發(fā)則判定具有活性，如不萌發(fā)則判定不具有活性。8樣品與原始數(shù)據(jù)保存8.1樣品保存存查樣品應(yīng)在4℃條件下妥善保存6個(gè)月。如發(fā)現(xiàn)具有活性的油菜莖基潰瘍病菌孢子的，該樣品應(yīng)保存1年，以備復(fù)驗(yàn)，如涉及貿(mào)易糾紛則應(yīng)保存到糾紛解決完畢。保存期滿后，需經(jīng)滅菌處理。8.2原始數(shù)據(jù)保存樣品檢測結(jié)束后，其原始記錄單和檢驗(yàn)結(jié)果或證書應(yīng)歸檔，妥善保管，以備復(fù)驗(yàn)、談判和仲裁。4(資料性)油菜莖基潰瘍病菌相關(guān)信息A.1基本信息英文名：Crucifersstemcanker,Crucifersblackleg,Phomaleafspot,Cruciferscanker,Crucifersdryrot,Blacklegofcabbage分類地位：真菌界(Fungi),子囊菌門(Ascomycota),座囊菌綱(Dothideomycetes),格孢腔菌目(Pleosporales),小球腔菌科(Leptosphaeriaceae),小球腔菌屬(Leptosphaeria)傳播途徑：病菌以子囊殼和菌絲體在病殘?bào)w中越夏和越冬。菌絲體在土中可存活2年～3年，在種子內(nèi)可存活3年，子囊殼在殘株中可存活5年以上。病菌分生孢子可借風(fēng)雨做短距離傳播，病殘?bào)w和帶菌種子是遠(yuǎn)距離傳播的主要方式。A.2寄主范圍主要寄主是油菜以及其他十字花科蔬菜，包括蕓墓屬(Brassica)的一些種，例如油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘藍(lán)(B.oleracea)、花椰菜(B.oleraceavar.botrytis)、結(jié)球甘藍(lán)(B.oleraceavar.capitata)、蕪菁(B.campestris);野生寄主有蔥芥(Alliariapetiolata)、菊科(Asteraceae)、龍膽目(Gentianales)、屈曲花屬(Iberis),香雪球(Lobulariamaritima)、紫羅蘭屬(Matthiola)、柳葉菜科(Onagraceae)、蘿卜屬(Raphanus)、野芥(Sinapisarvensis)和薪莫(Thlaspiarvense)。A.3癥狀病菌在寄主花期、收獲后和生長期侵染植株葉片、根部、莖部和整個(gè)植株。幼嫩的組織更易受到侵染。主要為害癥狀是葉部損壞、變色，莖部潰瘍，嚴(yán)重的整個(gè)植株死亡。幼苗的莖、葉上有灰色斑點(diǎn)，成株的莖基部有凹陷的潰瘍斑，上有黑色小點(diǎn)。重病株易折斷，根部病斑長條形，易腐朽。病菌子囊孢子在適宜條件下沉降于葉片表面，侵入定殖，在葉片組織中擴(kuò)展，導(dǎo)致莖部系統(tǒng)性的潛在侵染，最終發(fā)展為莖潰瘍。5(資料性)油菜莖基潰瘍病菌孢子染色結(jié)果圖圖B.1～圖B.4為PI染料對油菜莖基潰瘍病菌孢子的不同染色效果圖(普通熒光顯微鏡)。圖B.1PI染料對活孢子在明場下的染色效果圖B.3PI染料對死孢子在明場下的染色效果圖B.2PI染料對活孢子在熒光通道下的染色效果圖B.4PI染料對死孢子在熒光通道下的染色效果6[1]ZhangX,WhiteRP,DemirE,etal.Leptosphaeriaspp.,phomastemcankerandpotentialspreadofL.maculansonoilseedrapecropsinChina[J].PlantPathology,2014,63(3):598-612.[2]BrunH,ChèvreAM,FittBDL,etal.QuantitativeresistanceincreasesthedurabilityofqualitativeresistancetoLeptosphaeriamaculansinBrassicanapus[J].NewPhytologist,2010,185[3]WestJS,KharbandaPD,BarbettiMJ,etal.EpidemiologyandmanagementofLepto-sphaeriamaculans(phomastemcanker)onoilseedrapeinAustralia,CanadaandEurope[J].PlantPa-thology,2001,50(1):10-27.[4]周國梁，尚琳琳，于翠，等.進(jìn)境油菜籽中黑脛病菌和莖基潰瘍病菌的檢測[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2010(4):289-294.[5]王振華，楊武，趙暉，等.加拿大進(jìn)境油菜籽莖