《水環(huán)境監(jiān)測(cè)》課件-學(xué)習(xí)情景42 總大腸菌群的測(cè)定

室內(nèi)環(huán)境檢測(cè)與控制技術(shù)專(zhuān)業(yè)資源庫(kù)ProfessionalResourceBaseofIndoorEnvironmentalInspectionandControlTechnology總大腸菌群的測(cè)定——多管發(fā)酵法一

預(yù)備知識(shí)總大腸菌群是指那些能37℃48h之內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌。主要包括有埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬等菌屬的細(xì)菌。糞便中存在有大量的大腸菌群細(xì)菌，在水體中存活的時(shí)間和對(duì)氯的抵抗力等與腸道致病菌，如沙門(mén)氏菌、志賀氏菌等相似，因此將總大腸菌群作為水體受糞便污染的指示菌是合適的。但在某些水質(zhì)條件下，大腸菌群細(xì)菌在水中能自行繁殖，這是不利之處。一

預(yù)備知識(shí)總大腸菌群的檢驗(yàn)方法中，多管發(fā)酵法可適用于各種水樣（包括底泥），但操作較繁，需要時(shí)間較長(zhǎng)；濾膜法主要適用于雜質(zhì)較少的水樣，操作簡(jiǎn)單快速。多管發(fā)酵法是根據(jù)大腸菌群細(xì)菌能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣以及革蘭氏染色陰性、無(wú)芽孢、呈桿狀等有關(guān)特性，通過(guò)三個(gè)步驟進(jìn)行檢驗(yàn)，以求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。一

預(yù)備知識(shí)多管發(fā)酵法是以最可能數(shù)簡(jiǎn)稱(chēng)MPN來(lái)表示試驗(yàn)結(jié)果的。實(shí)際上它是根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)理論，估計(jì)水體中的大腸桿菌密度和衛(wèi)生質(zhì)量的一種方法。如果從理論上考慮，并且進(jìn)行大量的重復(fù)檢定，可以發(fā)現(xiàn)這種估計(jì)有大于實(shí)際數(shù)字的傾向。不過(guò)只要每一稀釋度試管重復(fù)數(shù)目增加，這種差異便會(huì)減少，對(duì)于細(xì)菌含量的估計(jì)值，大部分取決于那些既顯陽(yáng)性又顯陰性的稀釋度。因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，水樣檢驗(yàn)所要求重復(fù)的數(shù)目，要根據(jù)所要求數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度而定。二實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備準(zhǔn)備事宜名稱(chēng)方法樣品的采集和保存

水樣采集在經(jīng)滅菌的玻璃瓶?jī)?nèi)，要盡快分析，一般不宜超過(guò)2h，否則應(yīng)4℃保存，可保存12h。準(zhǔn)備事宜名稱(chēng)方法實(shí)訓(xùn)試劑水蒸餾水或純水。乳糖蛋白胨培養(yǎng)液成分：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，乳糖5g，氯化鈉5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸餾水1000ml。制法：將蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝于含有倒置的小玻璃管的試管中，于高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min，貯存于暗處備用。二實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備準(zhǔn)備事宜名稱(chēng)方法

實(shí)訓(xùn)試劑

三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述配方比例三倍（除蒸餾水外），配成三倍濃縮的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液，制法同上。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氫二鉀（K2HPO42.0g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，2%伊紅水溶液20ml，0.5%美藍(lán)水溶液13ml。制法：①貯備培養(yǎng)基：先將瓊脂加至900ml蒸餾水中，加熱融化，然后加入磷酸氫二鉀及蛋白胨，混勻使之溶解，再以蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，調(diào)整pH為7.2~7.4。趁熱用脫脂棉或多層紗布過(guò)濾，再加入乳糖，混勻后定量分裝于燒瓶?jī)?nèi)，置高壓蒸汽滅菌器中，在115℃滅菌20min。貯存于冷暗處備用。②平板培養(yǎng)基：將貯備培養(yǎng)基加熱融化。以無(wú)菌操作，根據(jù)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基的容量，用滅菌吸管按比例吸取一定量已滅菌的2%伊紅水溶液及0.5%美藍(lán)水溶液加入已融化的貯備培養(yǎng)基內(nèi)，并充分混勻（防止產(chǎn)生氣泡）。當(dāng)混合好的培養(yǎng)基冷至45℃，便立即適量?jī)A入已滅菌的空平皿內(nèi)，待其冷卻凝固后，倒置冰箱內(nèi)備用。二實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備三分析步驟生活飲用水飲用水源水和較清潔的地表水嚴(yán)重污染的地表水和廢水在二個(gè)裝有已滅菌的50ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無(wú)菌操作各加入已充分混勻的水樣100ml將水樣作1︰10稀釋于各裝有5ml三倍乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的五個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），各加10ml水樣初發(fā)酵試驗(yàn)的接種水樣應(yīng)作1︰10，1︰100，1︰1000或更高的稀釋在10支裝有已滅菌的5ml三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無(wú)菌操作各加入充分混勻的水樣10ml于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的10個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），其中5管各加入1ml水樣，另5管各加入1ml1︰10稀釋的水樣于各裝有10ml乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的15個(gè)試管中（內(nèi)有倒管），其中5管各加入1ml1︰10稀釋的水樣，5管各加入1ml1︰100稀釋的水樣，5管各加入1ml1︰100稀釋的水樣初發(fā)酵試驗(yàn)三分析步驟各管（瓶）混勻后置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h經(jīng)初發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)24h后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸發(fā)酵試管，分別用接種環(huán)劃線接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上置37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18~24h挑選符合下列特征的菌落，取菌落的一小部分進(jìn)行涂片、革蘭氏染色、鏡檢。①深紫黑色，具有金屬光澤的菌落；②紫黑色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；③淡紫紅色，中心色較深的菌落。平板分離三分析步驟涂片鏡檢菌落如為革蘭氏陰性無(wú)芽孢的桿菌，挑選該菌落另一部分接種于普通濃度蛋白胨培養(yǎng)液中（內(nèi)有倒管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管（瓶）的最典型菌落1~3個(gè)。置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h。有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，即證實(shí)有總大腸菌群存在。根據(jù)陽(yáng)性管（瓶）數(shù)，按糞大腸菌群的方法報(bào)告每升水樣中總大腸菌群數(shù)。復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三分析步驟樣品編號(hào)接種水量（ml）初發(fā)酵時(shí)水樣呈陽(yáng)性數(shù)復(fù)發(fā)酵時(shí)水樣呈陽(yáng)性數(shù)MPN值（個(gè)/100ml）總大腸菌群（個(gè)/L）備注

分析人

校對(duì)人