實(shí)驗(yàn) DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定課件-2023-2024學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

1.目的基因的篩選和獲取-前提利用PCR獲取和擴(kuò)增化學(xué)方法人工合成2.構(gòu)建基因表達(dá)載體-核心目的基因、啟動子、終止子、

標(biāo)記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞-關(guān)鍵農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(植物)、顯微注射法(動物)、

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法(微生物);4.目的基因的檢測與鑒定-保證分子檢測：是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強(qiáng)度等。基因工程的基本操作程序（4個步驟）目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并可進(jìn)行遺傳、表達(dá)和發(fā)揮作用。目的：確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá)。前情回顧核心步驟基因工程的基本操作程序前情回顧基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）帶有黏性末端或平末端的切口目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）相同限制酶終止子：終止轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因：便于重組DNA分子的篩選和鑒定。啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞新性狀植株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法操作程序目的基因?qū)胫参锛?xì)胞--植物組織培養(yǎng)Ti-DNA將目的基因插入植物細(xì)胞染色體DNA將目的基因插入到Ti質(zhì)粒上的T-DNA中基因工程的基本操作程序（4個步驟）前情回顧目的基因的檢測內(nèi)容及方法：

類型檢測內(nèi)容方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR，分子雜交等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個體是否具有相應(yīng)性狀抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等基因工程的基本操作程序前情回顧瓊脂糖凝膠電泳思考：如何對PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？第4課時第一章實(shí)驗(yàn)：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定學(xué)習(xí)目標(biāo)1、掌握DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定的原理2、了解PCR技術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳的過程自學(xué)指導(dǎo)：閱讀P84-85，限時4分鐘1.實(shí)驗(yàn)原理：①利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增的原理②DNA片段電泳鑒定的原理2.實(shí)驗(yàn)材料用具3.操作步驟（結(jié)合課時練P91頁）①DNA片段的擴(kuò)增

②DNA片段的電泳鑒定4.注意事項(xiàng)探究?實(shí)踐：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合，PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)；②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理；（1）DNA體外擴(kuò)增的原理①DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就是電泳；②PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)（遷移速率與之呈負(fù)相關(guān)）④凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。（2）DNA片段電泳鑒定的原理凝膠電泳原理示意圖1.儀器2.材料PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭、電泳裝置（包括電泳儀電泳槽等）4種脫氧核苷酸的等量混合液、2種引物、DNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無菌水、電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等微量離心管微量移液器PCR儀10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液（實(shí)為dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL3.PCR反應(yīng)體系的配方4、實(shí)驗(yàn)步驟（PCR）用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說明書，在微量移液管中依次加入各組分。待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子。將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部。（提高反應(yīng)速率）參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。移液離心擴(kuò)增預(yù)變性：使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合。根據(jù)待分離DNA片段的大小，用_______配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的________混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成

。配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠核酸染料加樣孔電泳緩沖液梳子孔為加樣孔，加樣孔側(cè)連電極負(fù)極。4、實(shí)驗(yàn)步驟（電泳鑒定）根據(jù)待分離DNA片段的大小，用_______配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的______混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成

。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與_______________混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的_____內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的________________

。配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠加樣核酸染料加樣孔電泳槽電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）加樣孔標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）填充電泳槽待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入__內(nèi)。將________加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。電泳緩沖液電泳緩沖液用來維持PH值，使DNA帶負(fù)電荷。4、實(shí)驗(yàn)步驟（PCR）根據(jù)待分離DNA片段的大小，用______配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的_____混勻。將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成

。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與______________混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的______內(nèi)。留一個加樣孔加入指示分子大小的________________

。配制瓊脂糖溶液制備瓊脂糖凝膠加樣電泳觀察接通電源，根據(jù)電泳槽___________來設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待_______前沿遷移接近凝膠邊緣時，停止電泳。取出凝膠置于____觀察和照相。核酸染料加樣孔電泳槽電泳緩沖液凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）加樣孔標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）陽極至陰極之間的距離紫外燈下指示劑填充電泳槽待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入

內(nèi)。將

加入電泳槽中，電泳緩沖液沒過凝膠1mm為宜。電泳緩沖液4、實(shí)驗(yàn)步驟（PCR）1.為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。2.該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。3.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。4.在進(jìn)行操作時，一定要戴好一次性手套。5.PCR擴(kuò)增不能隨意加大試劑用量。注意事項(xiàng)(1)你是否成功擴(kuò)增出DNA片段？判斷的依據(jù)是什么？(2)你進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果是幾條條帶？如果不止一條條帶，請分析產(chǎn)生這個結(jié)果的可能原因。

可以在紫外燈下直接觀察到DNA條帶的分布及粗細(xì)程度來評價擴(kuò)增的結(jié)果。進(jìn)行電泳鑒定的結(jié)果應(yīng)該是一條條帶，該片段大小約為750bp。

如果擴(kuò)增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反應(yīng)成分，各反應(yīng)成分的用量不當(dāng)，PCR程序設(shè)置不當(dāng)?shù)?。如果擴(kuò)增結(jié)果不止一條條帶，可能的原因有：引物設(shè)計(jì)不合理，它們與非目的序列有同源性或容易形成二聚體；退火溫度過低；DNA聚合酶的質(zhì)量不好等。小結(jié)：DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定實(shí)驗(yàn)原理：利用PCR在體外擴(kuò)增和DNA片段電泳鑒定的原理材料用具方法步驟1.DNA片段的擴(kuò)增2.DNA片段的電泳鑒定移液離心擴(kuò)增配制瓊脂糖溶液配制瓊脂糖凝膠填充電泳槽加樣電泳觀察1.利用PCR可以在體外進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增,下列有關(guān)“DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,錯誤的是 (

)A.PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理B.PCR利用了DNA的熱變性原理C.PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后,迅速融化D.在向微量離心管中添加反應(yīng)組分時,每吸取一種試劑后,移液器上的槍頭都必須更換C2.下列有關(guān)電泳的敘述,不正確的是 (

)A.電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B.待測樣品中DNA分子的大小和構(gòu)象、凝膠的濃度等都會影響DNA在電泳中的遷移速率C.進(jìn)行電泳時,帶電粒子會向著與其所帶電荷相同的電極移動