第二章-現(xiàn)代分離科學(xué)

第二章現(xiàn)代分離科學(xué)

在分析化學(xué)的研究和應(yīng)用中，雖然建立了大量有效的方法，但是這些方法能否解決所

有的分析問題這一直是在考驗分析化學(xué)研究人員的一個重大命題。在自然世界，物質(zhì)的存在

有其必然的規(guī)律，我們面臨的往往是復(fù)雜的研究對象，所謂復(fù)雜是指這些研究對象一般都是

有多個組分共存的，而且，就物質(zhì)世界本身的規(guī)律而言，越是容易共存的物質(zhì)，其性質(zhì)上就

越接近，越難于區(qū)分。另一類復(fù)雜物質(zhì)就是人們?yōu)樯a(chǎn)生活需要而人為故意制造的，也就是

通常所謂的配方，出于達到某種效果的需要，可能添加的成分的范圍非常廣泛。再則，象化

工生產(chǎn)等過程也難于避免副反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)品中一般都含有一定量的雜質(zhì)。象這樣的復(fù)雜樣

品對分析化學(xué)方法提出了特定的要求，這就是我們在討論分析化學(xué)方法時必須提出的技術(shù)指

標(biāo)之一，即方法是否具有選擇性。如果方法具有很高的選擇性，那就可以在復(fù)雜組分中檢測

出待測組分，整個分析過程就簡單而快捷，因此在分析化學(xué)發(fā)展的歷程中，人們開展了大量

的研究工作以追求分析方法的選擇性。但是，任何事物都不以人的意志為轉(zhuǎn)移，迄今為止，

真正意義上具有高的選擇性的方法并不多，一般的方法在測定中或多或少受到共存物質(zhì)的干

擾，甚至只能測定多種物質(zhì)的總量而無法分別測定，這顯然成為阻礙分析科學(xué)發(fā)展的一個重

大瓶頸。為解決這一問題，在分析化學(xué)發(fā)展的過程中，形成了形形色色的各種分離方法，所

謂分離即指將各種共存物質(zhì)彼此分開，從而達到不相互干擾測定的目的。經(jīng)典的分離方法包

括沉淀、溶劑萃取、離子交換等，這些方法一般需要比較大量的樣品和試劑，且以手工操作

為主，程序比較復(fù)雜，對操作要求高，效率和精度均較差。其后更為有效的分離方法如色譜

（層析）占據(jù)了分離方法的主流，包括氣相色譜、液相色譜等，作為自動化的分離手段，獲

得了較高的分離效率并方便了應(yīng)用，而且這些技術(shù)還可以與檢測技術(shù)聯(lián)用，包括各種類型的

檢測裝置如熱學(xué)、電子、光學(xué)、電化學(xué)檢測器及質(zhì)譜檢測器等，這樣色譜分離技術(shù)就和檢測

技術(shù)結(jié)合為一體同時完成了分離和分析兩大任務(wù)，因此色譜技術(shù)迅速發(fā)展成為分析科學(xué)領(lǐng)域

一個重要的學(xué)科分支。隨著研究的不斷深入和對分離工作的要求的提高，更多的分離技術(shù)也

在不斷涌現(xiàn)，如近些年很快發(fā)展起來的固相萃取、固相微萃取、液相微萃取等，也為分離技

術(shù)提供了更多的技術(shù)途徑。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，分析科學(xué)技術(shù)迅速滲透到生命科

學(xué)、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域，各種極其復(fù)雜的研究對象和特殊的樣品對分離技術(shù)提出了更高的要求,

在這樣的背景下，一系列新型的分離技術(shù)迅速地發(fā)展成熟起來，本章將重點介紹其中部分重

要的技術(shù)。

§2.1現(xiàn)代色譜分析技術(shù)

色譜分析已經(jīng)成為非常經(jīng)典和實用的分離分析技術(shù)，其基本的分離模式包括氣相色譜分

離和液相色譜分離，其中氣相色譜分離又包括基于吸附和分配的不同分離模式，液相色譜分

離的分離模式則更多，除吸附和分配外，還包括離子交換、空間排阻等。在這些經(jīng)典的色譜

分離基礎(chǔ)上，還發(fā)展形成了多種各具特色的現(xiàn)代色譜分離方法。

§2.1.1高效薄層色譜法

薄層色譜(thinlayerchromatography,TLC)是將固定相均勻涂抹在玻璃板(或塑料板/

鋁制薄板)上成膜，用毛細管或適當(dāng)?shù)狞c樣裝置將試樣點加在薄層的起始線上，等溶劑揮發(fā)

后置于展開槽內(nèi)用一定的溶劑展開，當(dāng)展開到適當(dāng)距離時取出，晾干、顯色后進行定性、定

量分析。薄層色譜具有操作簡單、快速、不怕污染，流動相選擇范圍寬，有利于不同性質(zhì)的

化合物的分離與分析等特點。

薄層色譜是20世紀(jì)50年代由Kirchner等由經(jīng)典柱色譜和紙色譜發(fā)展而來。20世紀(jì)

60年代，Stahl等對薄層色譜進行了標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)格化及擴大應(yīng)用等方面的工作，但由于自動

化、分辨率及重現(xiàn)性等方面的不足較長時間停留在定性和半定量水平上。20世紀(jì)70年代開

始，薄層色譜向儀器化、高效化發(fā)展，逐步形成了高效薄層色譜，即在高效薄層板上進行組

分分離，并用儀器代替手工操作，得到分辨率極高的色譜圖，再配以高質(zhì)量的薄層色譜掃描

儀，大大提高了薄層色譜定量結(jié)果的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。目前，高效薄層色譜已成為色譜領(lǐng)域

不可或缺的一個分支。樣品在薄層板上被分離的原理和柱色譜類似，按分離原理可分為吸附

薄層色譜、分配薄層色譜、離子交換薄層色譜和空間排阻薄層色譜等，其中應(yīng)用最廣泛的是

吸附薄層色譜。

1.薄層色譜的技術(shù)參數(shù)

薄層色譜的分離操作過程與柱色譜不同，其技術(shù)參數(shù)也不完全相同。

(1).定性參數(shù)

比移值Rf

?(2-1)

L為原點中心到樣品斑點中心的距離；匕為原點中心到溶劑前沿的距離，如圖2?1所

不。

前沿

c?

圖2-1薄層色譜圖及比移值

&值和樣品、固定相、展開劑的性質(zhì)均有關(guān)，可作為組分定性的參數(shù)。由圖1可知Rr

只能在0~1之間，實際操作中一般要求Rf在0.2~0.8之間。由于Rf值受到諸多因素的影

響，不同色譜條件下很難比較，控制色譜條件也比較有限，因此往往用相對比移值Rr來定

性。

(2-2)

R*i)和Rf⑸分別表示組分i和參考物質(zhì)s在同一條件下測得的Rf值。R,可大于也可小于

1,可消除系統(tǒng)誤差，所以重現(xiàn)性和可比性比Rf好。參考物質(zhì)可以是加入的純物質(zhì)，也可以

是樣品中的某一已知組分。

1966年Gaspanri等提出了保留常數(shù)值RM：

q=1虱：1)

公式2-3表明保留常數(shù)和化合物R「之間或與被測化合物結(jié)構(gòu)之間存在的關(guān)系，用其可

以推測同系物的RM值或鑒定同系物。

環(huán)形展開比移值Rfc為被分離物質(zhì)原點遷移的半徑與溶劑由原點至前沿半徑的比值。由

于直線展開時的移動距離與環(huán)形展開時的半徑的平方相當(dāng)，所以：

(Rfc)2=Rf

(2-4)

環(huán)形展開適用于Rf值比較小的化合物，因為在環(huán)形展開時，在高比移值范圍斑點扁平

較分散，而在低比移值范圍斑點集中，分離度好。

(2).相平衡參數(shù)

薄層色譜的相平衡參數(shù)和柱色譜相同，用分配系數(shù)K和分配比k表示。比移值Rf與分

配系數(shù)、分配比之間的關(guān)系為：

由2-5可知，Rf為1的組分，K或k為0,表示該組分不被固定相所保留；Rf為0的組

分，K或k趨于8,表示該組分不溶于流動相，不被流動相所洗脫而停留在原點。

(3).分離參數(shù)

分離度(resolution,R)是薄層色譜的重要分離參數(shù)：

Rc=---d---

(嗎+叼)

式中d為兩個斑點的中心距，/，叼分別為兩個斑點的寬度，如圖2-2所示?顯然,

薄層色譜中相鄰兩斑點之間的距離d越大，斑點面積越小，分離度越大，分離效能越好。

I-dT

W1W2

圖2-2薄層色譜的分辨率

分離數(shù)(separationnumber,SN)是衡量薄層色譜分離容量的主要參數(shù)。SN指相鄰斑

點的分離度為1.177時，在R尸0和Rt=l兩組分斑點之間能容納的色譜斑點數(shù)。

SN=—-—1

%+仇(2-7)

式中Lo指原點至前沿的距離，加和比分別為薄層掃描所得的Rf=0和R尸1的組分的

半峰寬。實際上b°和用不能由薄層掃描圖上直接得到，而是通過測量其他組分的Rf值和半

峰寬，線性回歸外推得到。經(jīng)典薄層板的SN在7~10,高效薄層板的SN在10~20范圍內(nèi)。

(4).板效參數(shù)

薄層色譜也是用理論塔板數(shù)(numberoftheoreticalplate,n)來表示分離效率的。n主

要決定于色譜系統(tǒng)的物理特性，如固定相的粒度、均勻度、活度以及展開劑的流速及展開方

式等。

n=16(—)2

W(2-8)

式中L為原點到斑點中心的距離，W為組分斑點的寬度。n越大表明該薄層板的效能

越高，斑點集中。普通TLC的n通常為600,高效TLC的n可達5000或更大。

和液相色譜一樣，理論塔板高度(heightofplate,H)也能表征分離效能。

?(2-9)

2.高效薄層色譜實驗技術(shù)

實現(xiàn)薄層色譜分析主要有兩種途徑，-是利用簡易的實驗室制備薄層板或商品薄層板采

用手工或半自動方式點樣、展開、顯色并進行定性和半定量分析。在實驗中主要考慮的問題

包括固定相和黏合劑的選擇、薄層板制備與活化、點樣方式的選擇、展開劑的選擇以及定性

和半定量的方法等，而現(xiàn)代高效薄層色譜則主要采用性能優(yōu)良的商品薄層板，采用自動點樣

裝置并利用高精度的薄層掃描儀完成分析測試工作，達到較高的分離分析水平。

(1).薄層色譜實驗技術(shù)要素

薄層色譜所用固定相和一般柱色譜相同，但粒徑較小，分離親脂性化合物常選用氧化

鋁、硅膠及聚酰胺；分離親水性化合物，常選用纖維素、離子交換纖維素、硅藻土及聚酰胺

等。在固定相中經(jīng)常需要加入黏合劑如饌石膏(CaSCV2H2O)、竣甲基纖維素鈉和淀粉等以

保證固定相的穩(wěn)定。有時為了分離某些物質(zhì)的特殊需要，還可加入少量熒光劑、pH調(diào)節(jié)劑、

絡(luò)合劑等物質(zhì)，制備成熒光薄層板、絡(luò)合薄層板、酸堿薄層板等。

在薄層色譜技術(shù)中，點樣是造成定量誤差的主要來源。點樣的一般要求是點樣量合適,

劑量準(zhǔn)確，點樣區(qū)帶窄，重現(xiàn)性好。點樣可采用手動點樣、半自動點樣和自動點樣。高效薄

層色譜展開方式有水平、上行、下行、徑向和雙向展開，上行展開是薄層色譜分離最常用的

方式。對組成復(fù)雜或組分間性質(zhì)較接近的試樣，一次展開難以完全分離，可在正方形薄層板

上采用雙向展開方式，兩次所用的展開劑可以相同也可以不同。展開劑的選擇是一個關(guān)鍵的

環(huán)節(jié)，展開劑（流動相）、被分離組分的極性和吸附劑的活性三者是相互關(guān)聯(lián)相互制約的，

為了獲得良好的分離，必須正確處理這三者的關(guān)系。圖2-3原則性地說明了這三者之間的關(guān)

系，在實際應(yīng)用中需仔細確定。

圖2-3樣品、吸附劑和展開劑性質(zhì)的關(guān)系

在一圓盤上標(biāo)有三種刻度，分別為分離物質(zhì)的極性、吸附劑的活度（I級最強，V級

最弱）和展開劑的極性。圓盤中心有一個可轉(zhuǎn)動的正三角形指針說明三者的關(guān)系，如圖中所

示，分離中等極性的被分離物質(zhì)，用活度n~HI級的吸附劑，展開劑則用中等極性。在展

開劑選擇中，首選單一展開劑，只有無法用單一展開劑或使用單一展開劑影響分離或無定性

方法時，才選擇混合溶劑作展開劑。

展開完畢后的薄層從展開劑中取出時需先標(biāo)出展開劑前緣的位置。有多種方法確定分

離斑點的位置，有色組分本身呈現(xiàn)明顯的斑點；有些化合物有紫外吸收，在紫外燈下顯現(xiàn)不

同顏色的暗點；有些化合物可用熒光或熒光猝滅斑點定位。光學(xué)方法檢測不僅方便而且不會

改變化合物的性質(zhì)，但對光敏化合物要注意避光，并盡量縮短紫外照射時間。除此之外，利

用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用生成不同顏色或產(chǎn)生熒光，或根據(jù)分離化合物的性質(zhì)選擇適當(dāng)

的顯色劑顯色均可實現(xiàn)斑點的定位。定位后斑點的位置和性質(zhì)可用于對化合物的定性，常用

斑點的L值和顯色特性來確定。因影響Rf的因素很多，根據(jù)一種展開劑展開得到的心值

作為定性依據(jù)是不夠的，通常需要經(jīng)過兩種以上不同組成的展開劑得到的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品一

致，才可認(rèn)定該斑點和標(biāo)準(zhǔn)品是同一化合物。

（2）薄層色譜（半）定量方法

薄層色譜（半）定量通常有目視比較、斑點面積、洗脫定量測定等方法。目視比較半

定量法通過比較展開后各斑點顏色的深淺估計組分的大概含量。展開后薄層上斑點的面積A

和含量W之間存在多種可能的線性關(guān)系，如IgW與A呈線性關(guān)系；IgW與4呈線性關(guān)系

或IgW與IgA呈線性關(guān)系，因此可在實驗確定具體的線性相關(guān)性后通過測量斑點的面積進

行定量測定。利用本方法進行定量對薄層色譜操作要求較嚴(yán)格，薄層的厚度、活度等要均勻

一致；點樣量與樣品斑點的大小要求一致；展開時展開劑的液面與原點間的距離以及展開劑

上升的速度和展開的距離也要求相同等。洗脫定量測定是目前較常用方法，其關(guān)鍵是洗脫的

效率，通常用合適方法將斑點部分的吸附劑取下并收集于4~5號砂芯漏斗中，在減壓抽濾

下用適當(dāng)?shù)娜軇⒈粶y組分洗脫。洗脫劑的選擇十分重要，應(yīng)選用既能完全洗脫被測組分，

又不干擾以后測定的溶劑，常用的有水、乙醇、甲醇、丙酮、氯仿、乙醛等，如果用單一的

溶劑洗脫效果不好也可用混合溶劑，洗脫完成后多采用可見-紫外分光光度法、熒光分光光

度法等進行定量測定。

3.薄層掃描法

薄層掃描法(thinlayerchromatographyscanning,TLCS)是薄層色譜技術(shù)與光學(xué)檢測技

術(shù)聯(lián)用的一種儀器分析方法，用一定波長和強度的光照射薄層分離后的斑點，并進行整個斑

點的掃描，用光電轉(zhuǎn)換元件檢測透過、反射以及熒光強度等以達到定量測定的目的。由于薄

層是由許多細小顆粒涂布成的半透明物體，但光照射到薄層表面時，除透射光、反射光，還

有相當(dāng)多的散射光，因此，薄層掃描和比色法不同，樣品和測定值之間并非簡單的線性關(guān)系，

特別在高濃度區(qū)這種情況更為明顯，因而在定量方式上有其特殊性，通常主要從測量信號類

型、測量波長的變化及光束掃描軌跡的變化等角度考慮改善測定性能。

(1).測量方法

薄層掃描測定法可分為兩類，一是紫外-可見吸收測定法，另一是熒光測定法。

1).紫外-可見吸收

根據(jù)對光的測定方式的不同可分為透射法、反射法、透射-反射法

透射法中入射光和光電倍增管安裝在薄層板的兩側(cè)，入射光通過薄層板上的斑點時，

由于部分被組分吸收而使光強減弱，透過薄板的光被光電檢測器轉(zhuǎn)化為電信號，經(jīng)放大后記

錄。因薄層板多用普通玻璃板，玻璃板對紫外光有吸收，所以只能用可見光對有色斑點進行

透射掃描。

反射法中入射光與光電檢測器安裝在薄層同側(cè)。單色光垂直照射到薄層斑點上，光電

檢測器置于45。角處檢測反射光強度。玻璃板對反射法測定無影響，紫外、可見光均能用，

是薄層掃描定量中經(jīng)常采用的方法。

透射-反射法是同時測定透射光及反射光，測得的兩種光信號相加。由于薄層較厚處，

透射光減弱而反射光相應(yīng)增強；薄層較薄處，透射光增強而反射光減弱，故二者之和可以補

償由于薄層厚度不均所造成的基線不穩(wěn)，靈敏度和精密度得到改善。

2).熒光測定法

在激發(fā)光的照射下，斑點中物質(zhì)本身有熒光或經(jīng)過熒光衍生的化合物，可測定其發(fā)射

的熒光強度而進行定量。熒光法的光源通常是汞燈或俶燈，若用反射法測量斑點被激發(fā)發(fā)射

的熒光，在光電倍增管前需放置二級濾光片以濾除散射的激發(fā)光；若以透射法測量，激發(fā)光

為紫外光，薄層板所用的玻璃可起到二級濾光片的作用。熒光測定法靈敏度高，因而點樣量

少，相應(yīng)地改善了分離效果。由于物質(zhì)濃度與熒光強度存在良好的線性關(guān)系，斑點形狀不同

對測量值影響不大。

熒光猝滅使用含有熒光指示劑的薄層板，在紫外光的照射下，斑點中組分使熒光指示

劑產(chǎn)生的熒光強度減弱，借助測量熒光強度減弱的程度測出斑點中組分的含量。熒光猝滅的

測量中，組分濃度與熒光強度沒有很好的線性關(guān)系，其定量關(guān)系需由具體實驗確定。

(2).單波長和雙波長掃描

1).單波長掃描

使用單一波長對薄層進行掃描，又可分為單光束和雙光束。單光束的掃描儀無法消除

薄層厚度不均、顯色不均的影響，對薄層制作要求很高。雙光束掃描儀中光源發(fā)出的光經(jīng)過

分束器被分成兩條均等的光束，一束照在斑點部位，另一束照在斑點鄰近空白薄層上，記錄

兩條光束掃描所得的吸光度。但雙光束掃描儀測得的空白值并非斑點所在的部位，故只能在

一定程度上消除薄層背景不均勻的影響。

2).雙波長掃描

雙波長掃描是采用兩個不同波長的光束先后掃描所要測定的斑點，并記錄兩波長吸光

度之差。兩種波長的選擇，通常是選擇斑點中組分的吸收峰波長作為樣品測定波長，組分無

吸收的波長作為參比波長。在雙波長掃描中，由于對樣品掃描進行了背景扣除，使薄層背景

的不均勻性得到補償，掃描曲線的基線較為平直，測定精度得到改善。

(3).掃描軌跡

根據(jù)掃描時光束軌跡的不同，掃描方式有直線掃描、鋸齒狀掃描和圓形掃描。直線掃

描是用一定面積的光束以直線軌跡掃描通過斑點，光束應(yīng)將整個斑點包括且對準(zhǔn)斑點中心，

掃描測得的是光束在斑點各部分的吸光度之和。由于薄層掃描中吸光度和樣品含量之間不一

定呈線性關(guān)系，故對外形不規(guī)則即不呈圓形的斑點，光束從斑點的不同方向掃描得到的吸光

度積分值不同，因此直線掃描對外形規(guī)則的斑點比較適用。

鋸齒狀掃描以一定大小的正方形小光點呈鋸齒狀軌跡掃描前進，如圖2-4所示。光點

的大小可隨斑點面積大小進行調(diào)節(jié)，這種掃描方式特別適合外形不規(guī)則的斑點，從不同的方

向掃描可得到基本一致的吸光度積分值。

Y?光束截面

1]_______________J_______________________

光束軌跡

圖24薄層掃描方式

圓形掃描用于圓心式或向心式展開后所得的圓形色譜的掃描測定，可以用光束由圓心

向圓周方向掃描，也可以將光束沿一定半徑的圓周方向移動，光束長軸可與圓周一致，也可

與圓周垂直進行掃描。

4.薄層色譜應(yīng)用

薄層色譜是應(yīng)用比較廣泛的分離方法之一，主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：

（1）.中草藥和中成藥的成分分析

中草藥和中成藥成分極為復(fù)雜，自從薄層色譜被采用以來，幾乎成了分析中草藥和中

成藥成分的首先方法。長期以來薄層色譜在中藥材中成藥的質(zhì)量分析方面起了積極作用。

中藥材品種主要靠斑點比移值、斑點顏色及薄層指紋圖譜來鑒別。由于中藥材質(zhì)量受

產(chǎn)地、栽培條件、生長周期、采收季節(jié)、加工方法等因素的影響，而中成藥的藥效也會受原

料質(zhì)量、工藝方法等因素的影響，只靠顯微鑒別、理化鑒別、含量測定等方法不足以鑒別成

分復(fù)雜的中草藥和中成藥。目前國際上通用的辦法是采用指紋圖譜的方法，指紋圖譜可以通

過對體系化學(xué)成分的物理指標(biāo)的表征，將物質(zhì)體系的內(nèi)涵表達出來，從而達到對體系整體性

的描述，這正好符合中醫(yī)藥整體綜合的特點。我國藥典中收錄了101個中藥品種的多幅彩色

薄層譜圖，供分析工作者參考。薄層分離指紋圖譜的建立，為鑒別藥材的真?zhèn)?、產(chǎn)地、生長

年代提供了技術(shù)手段，也為藥材種植的條件選擇提供了便利。

薄層色譜在合成藥物中的應(yīng)用也很廣泛，如磺胺、巴比妥、抗生素、生物堿等。

(2).化工原料及化學(xué)反應(yīng)進程的控制

用薄層色譜分析有機化工原料，操作簡單易行。如各種官能團的有機物、石油產(chǎn)品、

塑料單體、橡膠裂解產(chǎn)物、油漆原料、合成洗滌劑原料等均可采用薄層色譜監(jiān)測原料質(zhì)量。

在化學(xué)反應(yīng)過程中，反應(yīng)終點可以通過定期檢驗反應(yīng)產(chǎn)物中原料和目標(biāo)產(chǎn)物的量來判斷。如

果到達反應(yīng)終點，目標(biāo)產(chǎn)物的濃度達到最大值，原料濃度降到最小，都可以通過薄層色譜來

確定。

(3).在食品分析、毒物分析、法醫(yī)化學(xué)和環(huán)境污染物分析等方面的應(yīng)用

食品中的營養(yǎng)成分是蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、油和脂肪、維生素和食用色素等，以及

可能存在的有害物質(zhì)如殘留農(nóng)藥、致癌的黃曲霉等，都可用薄層色譜法定性和定量。

毒物分析和法醫(yī)化學(xué)也很多采用薄層色譜等手段，對麻醉藥、巴比妥、印度大麻、鴉

片生物堿等均可分析。另外，很多環(huán)境污染物如多環(huán)芳燒、酚類物質(zhì)等均可用薄層色譜進行

分析。

§2.1.2凝膠色譜法

凝膠色譜法(gelchromatogr叩hy)又稱分子排阻色譜法，是20世紀(jì)60年代初發(fā)展起

來的一種快速而又簡單的分離分析技術(shù)，主要用于測定高聚物分子量及其分布。根據(jù)分離對

象的水溶性不同，又可分為凝膠過濾色譜(GFC)和凝膠滲透色譜(GPC)。凝膠過濾色譜

主要以水為洗脫溶劑分離水溶性的大分子如多糖類化合物，常用的凝膠是葡聚糖系列。凝膠

滲透色譜法主要用于有機溶劑中可溶的高聚物相對分子質(zhì)量分布分析及分離，常用的凝膠為

交聯(lián)聚苯乙烯凝膠，洗脫溶劑為四氫吠喃等有機溶劑。凝膠色譜不但可以用于分離測定高聚

物的相對分子質(zhì)量和分布，而且已經(jīng)被生物化學(xué)、分子生物學(xué)、生物工程學(xué)、分子免疫學(xué)以

及醫(yī)學(xué)等有關(guān)領(lǐng)域廣泛采用以研究生物大分子。

高分子化合物的性能與其分子量有密切的關(guān)系，尤其是其機械性能、加工性能和溶液

性能都是隨分子量而顯著改變的，同時分子量的分布也對這些性能產(chǎn)生顯著的影響，因此,

研究高分子化合物的分子量及其分布是非常重要的。測定高分子化合物分子量的傳統(tǒng)方法包

括端基分析、沸點上升、冰點下降、滲透壓、粘度、散射、離心等方法，凝膠色譜是高分子

化合物分子量分析領(lǐng)域最先進的方法之一。

1.凝膠色譜法基本原理

(1).分子篩效應(yīng)

高分子鏈上的碳碳單鍵是能轉(zhuǎn)動的，隨著分子鏈的增長，高分子的長鏈會扭曲成一個

線團形狀，分子量大的線團體積大，分子量小的線團體積小。含有不同大小分子的樣品溶液

緩慢地流經(jīng)凝膠色譜柱時，各分子在柱內(nèi)同時進行著隨流動相往前的移動和無定向的擴散運

動。大分子物質(zhì)由于直徑較大，不易進入凝膠顆粒的微孔，而只能分布顆粒之間，所以在洗

脫時向前移動的速度較快。小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆

粒的微孔中，即進入凝膠相內(nèi)，并不斷從一個凝膠內(nèi)擴散到顆粒間隙后再進入另一凝膠顆粒,

如此不斷地進入和擴散，所以向前移動的速度落后于大分子物質(zhì)，從而樣品中分子大的先流

出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。具有多孔的

凝膠就是分子篩，各種分子篩的孔隙大小分布有一定范圍，分子直徑比凝膠最大孔隙直徑大

的，全部被排阻在凝膠顆粒之外，這種情況叫全排阻。兩種全排阻的分子即使大小不同，也

不會有分離效果。直徑比凝膠最小孔直徑小的分子能進入凝膠的全部孔隙，如果兩種分子都

能全部進入凝膠孔隙，即使它們的大小有差別，也不會有好的分離效果，因此，一定的分子

篩有它一定的使用范圍。

對于分子大小不同，但同屬于凝膠分離范圍內(nèi)的各種分子，在凝膠柱中的分布情況也

是不同的：分子較大的只能進入孔徑較大的那一部分凝膠孔隙內(nèi)，而分子較小的可進入較多

的凝膠顆粒內(nèi)，這樣分子較大的在凝膠柱內(nèi)移動距離較短，分子較小的移動距離較長。同時，

凝膠本身具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大的分子在進入這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上的孔隙時阻力較大，小分子進

入時則阻力較小，于是分子較大的先通過凝膠柱而分子較小的后通過凝膠柱，這樣就利用分

子篩可將分子量不同的物質(zhì)分離，分子量大小不同的多種成份在通過凝膠柱時，按照分子量

大小排隊，表現(xiàn)出分子篩效應(yīng)。當(dāng)然凝膠色譜分離作用實際上比上述過程要復(fù)雜些，還牽涉

到樣品與凝膠表面及淋洗液間的分子間作用力等因素。

對凝膠色譜分離機理的理解還需要考慮以下因素：

1).平衡排除：其一是所謂構(gòu)象降低，高分子化合物被理解為無規(guī)線團，當(dāng)其進入凝

膠孔洞內(nèi)時，只有部分構(gòu)象能夠存在，而且分子量越大，構(gòu)象越少。二是立體排斥，高分子

線團在孔內(nèi)的活動范圍與其分子量相關(guān)，其減小的厚度為高分子線團的有效半徑。

2).限制擴散：溶質(zhì)分子在凝膠柱中的分配未必會達到平衡。因為大小不同的分子的

擴散速度是不同的，分子的擴散系數(shù)隨R/a的增大而迅速減小(R為分子半徑，a為孔的截

面半徑)。同樣條件下，小的分子不僅能進入孔洞內(nèi)，而且可以進入孔洞的深處，從而滯留

的時間長，而大的分子，由于擴散慢，只能孔洞的表面，存在所謂“有限擴散”現(xiàn)象，尤其

是當(dāng)流動相速率較大時，不能達到平衡。

3).流動分離：按照流體動力學(xué)理論，流動相在孔洞中的移動存在一個拋物線型的流

速場，即中間流速大，周圍流速小，而分子越大，越容易被集中在流速場的中間，從而隨流

動相的移動加快，而較小的分子則分布于流速場的周圍，移動速率小。

(2).凝膠色譜柱的重要參數(shù)

1).柱體積：柱體積是指凝膠裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。常用Vt表

ZjSo

2).外水體積：色譜柱內(nèi)凝膠顆粒間隙，這部分體積稱外水體積，亦稱間隙體積，常

用Vo表示。

3).內(nèi)水體積：因為凝膠為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顆粒內(nèi)部仍有空間，液體可進入顆粒內(nèi)部,

這就分間隙的總和為內(nèi)水體積，又稱定相體積，常用Vi表示。不包括固體支持物的體積(Vg)。

4).峰洗脫體積：是指被分離物質(zhì)通過凝膠柱所需洗脫液的體積，常用Ve表示。當(dāng)樣

品的體積很小時(與洗脫體積比較可以忽略不計)，在洗脫圖中，從加樣到峰頂位置所用洗

脫液體積為Ve。

(3).高聚物的分子量及其分布

高聚物的分子量是個分散性體系，有的分子分子量大，有的分子分子量小，這就產(chǎn)生

了一個分子量分布和分子量統(tǒng)計方法的問題，從理論上講，一個高分子樣品中，分子量很大

的分子數(shù)不會多，同樣分子量很小的分子數(shù)也不會多，而分子量適中的分子數(shù)是主要的，因

此分子量的分布應(yīng)趨向于正態(tài)分布。

設(shè)高分子樣品中某一小部分I的分子量是相同的，為Mi,其分子數(shù)目為Ni,質(zhì)量為

Wi,則這個樣品的：

重均分子量為(2-10)

數(shù)均分子量為(2-11)

M

D=—匚

分子量分布寬度為M.(2-12)

Mw是以不同分子量的分子質(zhì)量分?jǐn)?shù)統(tǒng)計的樣品的平均分子量；Mn是以不同分子量

的分子數(shù)目分?jǐn)?shù)統(tǒng)計的樣品的平均分子量；高分子的D值越小表明分子量的分散性越小。

一般分子量測定標(biāo)樣的D小于1.1。凝膠色譜儀可測定Mw、Mn和D值并計算出黏均分子

量M，，等，在這些數(shù)據(jù)中最重要的是重均分子量Mw。

2.常用凝膠的種類及性質(zhì)

(1).聚丙烯酰胺凝膠

是一種人工合成凝膠，是以丙烯酰胺為單體，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)，經(jīng)干燥粉碎或

加工成形制成粒狀，控制交聯(lián)劑的用量可制成各種型號的凝膠。交聯(lián)劑越多，孔隙越小。

(2).交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)

交聯(lián)葡聚糖的商品名為Sephadex,不同規(guī)格型號的葡聚糖用英文字母G表示，G后面

的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠吸水值的10倍，如SephadexG-25即為每克凝膠膨脹時吸水2.5克的葡聚

糖。SephadexLH-20是SephadexG-25的竣丙基衍生物，能溶于水及親脂溶劑，用于分離不

溶于水的物質(zhì)。

(3).瓊脂糖凝膠

瓊脂糖凝膠是依靠糖鏈之間的次級鏈如氫鍵來維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的疏密依靠瓊

脂糖的濃度。一般情況下，它的結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，可以在許多條件下使用。瓊脂糖凝膠在40℃

以上開始融化，也不能高壓消毒。

(4).聚苯乙烯凝膠(Styrogel)

具有大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，可用于分離分子量1600到40,000,000的生物大分子，適用于有

機多聚物分子量測定和脂溶性天然物的分級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用甲基亞碉。

3.凝膠色譜儀及實驗技術(shù)

凝膠色譜儀的基本結(jié)構(gòu)與液相色譜類似，見圖2-5o流動相經(jīng)高壓計量泵輸入凝膠色

譜柱，樣品經(jīng)進樣器注入，被流動相帶入凝膠色譜柱進行分離，分子量大的部分先被淋洗出

色譜柱，分子量小后被淋洗出色譜柱，被分離后的樣品流入示差折光檢測器，因樣品的折射

率的變化而產(chǎn)生折射差值信號，經(jīng)光電轉(zhuǎn)換后的信號被放大記錄。

進樣器

總壓期//

圖2-5凝膠色譜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

（1）.高壓流量泵

在凝膠色譜應(yīng)用中，高分子的分子量是以出峰時間為依據(jù)進行計算的，因此流量的穩(wěn)

定非常重要。目前大多使用2個柱塞泵并聯(lián)組成計量泵，這2個并聯(lián)柱塞泵往復(fù)互補以減少

流量的脈動，要求較高的泵其流量波動的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1%以下。

（2）.樣品溶液的處理

樣品溶液如有沉淀應(yīng)過濾或離心除去，如含脂類可高速離心或通過SephadexG-15短

柱除去。樣品的粘度不可大，粘度高影響分離效果，含蛋白不超過4%。

（3）.凝膠色譜柱

色譜柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑，但直徑加大，洗脫

液體體積增大，樣品稀釋度大。分離度與柱高的平方根相關(guān)，但軟凝膠柱過高會擠壓變形阻

塞。凝膠的粒度也影響分離效果，粒度細分離效果好，但阻力大，流速慢。商品凝膠是干燥

的顆粒，根據(jù)柱體積估計所需干膠的量，使用前在欲使用的洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，

可用加熱法，即在沸水浴中將濕凝膠逐漸升溫至近沸，這樣可大大加速膨脹，通常在1-2小

時內(nèi)即可完成。這種方法不但節(jié)約時間，而且還可消毒，除去凝膠中污染的細菌和排除膠內(nèi)

的空氣。經(jīng)常使用的凝膠如交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖都是多糖類物質(zhì)，需防止微生物的生長。常

用的抑菌劑有疊氮鈉（NaN）、可樂酮［CbC-C（OH）（CH3）2］、乙基汞代疏基水楊酸鈉和苯基

汞代鹽等。

（4）.檢測器

示差折光檢測器是凝膠色譜通用的檢測器。檢測器由參比池和樣品池組成，被分離的

樣品流經(jīng)樣品池時，樣品池的折射率與參比池的折射率之間產(chǎn)生差值，發(fā)出折射率改變的信

號。折射率和溫度有關(guān)，溫度細微變化會引起折射率的波動，因此檢測器的溫度控制要有很

高的精度。

（5）.分子量的測定

凝膠色譜法分析高分子化合物的分子量，要先用已知分子量的高聚物如聚苯乙烯標(biāo)樣

做工作曲線，依據(jù)工作曲線對未知樣品進行測定。實驗過程中根據(jù)不同樣品的分子量選擇合

適的凝膠色譜柱，還要考慮選擇合適的流動相。典型的保留時間和分子量之間的相關(guān)性如圖

2-6所示。

應(yīng)用中需要注意以下問題：

1).凝膠色譜分析前，必須完全除去樣品中的粉質(zhì)。

2).進樣前要盡量除去溶劑。常見溶劑有各自的折射率，如果比流動相折射率低的溶

劑混進樣品，會在色譜圖上形成負峰；如果比流動相折射率高的溶劑混進樣品又不能很好分

離的話，會使數(shù)均分子量明顯偏低，使分子量分布寬度D值明顯增大。

3).要獲得準(zhǔn)確的分子量和分子量分布，必須注意色譜柱分子量范圍、標(biāo)樣分子量范

圍和被測分子分子量范圍三者之間的關(guān)系。正確的覆蓋關(guān)系為：柱分子量范圍2標(biāo)樣分子量

范圍2被測分子分子量。柱的分子量范圍一定要明顯高出測試樣品的分子量范圍，如分析相

對分子量為6萬的樣品，柱的分離極限應(yīng)在30萬以上。

§2.1.3親和色譜

親和色譜(affinitychromatrgraphy,AC),是利用生物分子，特別是生物大分子與親和色

譜固定相表面配體之間存在的生物學(xué)和生物化學(xué)過程的特效性親和吸附作用，來進行選擇性

分離生物分子的方法。

生物大分子如肽、蛋白質(zhì)、核酸等有一個共同特性，即具有以特有的高效方式去識別

或鍵合到其他分子上的能力，正因為如此所有生物大分子可借助親和作用過程進行分離和純

化。自20世紀(jì)50年代至今，親和色譜已在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、

生物工程、臨床醫(yī)學(xué)、新型高效藥物研究中成為常規(guī)的分離、分析和制備的有效工具，并且

在生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能研究中，成為一種普遍采用的方法。

I.親和色譜基本原理和類型

親和色譜固定相上鍵合的配位體與被分離的生物活性目標(biāo)分子之間的相互作用，可用

鎖鑰結(jié)構(gòu)絡(luò)合物(lock-and-keystructuralcomplex)的形成來表示，如圖2-7所示。生物活性

分子和配體之間的相互作用受范德華力、疏水作用力、靜電引力、絡(luò)合作用力和空間位阻效

應(yīng)等多種因素影響，正是這種相互作用力的差異，才使得不同種類的生物分子獲得分離。

親和色譜法的突出特點是可對天然生物活性物質(zhì)進行高特效性的分離和純化，具有高

的濃縮效應(yīng)，可從大量樣品基體中分離、純化出所希望獲取的少量生物活性物質(zhì)。和高效液

相色譜中廣泛使用的僅利用疏水性差異的單一模式的反相色譜柱不同，在親和色譜分析中廣

泛使用依據(jù)不同分離模式的特效性識別柱，這些不同類型親和柱的使用可依據(jù)被分離目標(biāo)分

子的需求來決定。研究鎖鑰絡(luò)合物解吸過程的化學(xué)動力學(xué)是發(fā)展親和色譜的分析應(yīng)用和制備

分離的關(guān)鍵問題。

親和色譜已獲得了巨大的進展，依據(jù)生成鎖鑰結(jié)構(gòu)、可逆離解配位機理的不同，已發(fā)

展了多種方法，依據(jù)親和色譜固定相鍵合配位體的不同，可將親和色譜方法進行分類，見表

2-1

表2-1親和色譜法的分類

方法名稱分離機理應(yīng)用對象

生物特效親和色譜法利用可形定鎖鑰結(jié)構(gòu)的不同生生物活性物質(zhì)如肽、蛋白質(zhì)、

物分子間的生物特效識別功能核甘酸、抗原、抗體、病毒、

細胞碎片等

染料配位親和色譜法利用生物分子與三嗪或三苯甲烷核甘、核堿、核昔酸、核酸

染料間的特殊性相互親和作用與核酸鍵合的蛋白質(zhì)、生物酶

定位金屬離子親和色譜法利用生物分子與金屬離子一有肽、蛋白質(zhì)、核酸、生物酶

機試劑螯合物之間的特效性相

互親和作用

包合配合物親和色譜利用生物分子與環(huán)糊精（或冠手性氨基酸、多肽、生物酶、

酸、杯芳燒）及其衍生物之間的纖維素細胞生長因子、凝固因

特效包合作用子、脂蛋白及多種手性藥物

電荷轉(zhuǎn)移親和色譜法利用生物分子與口卜咻衍生物之氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核堿、

間的電子給予和電子接受基團核甘酸

間的特殊靜電吸引親和作用

共價親和色譜法利用含磕基的生物分子與含二含硫多肽和蛋白質(zhì)、含汞多

硫橋鍵配位體（2-毗咤二硫化聚核甘酸

物）間存在的特效親和作用

印跡分子親和色譜法利用生物分子與分子印跡聚合氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核甘

物之間的專一性分子識別作用，酸、輔酶

以實現(xiàn)高選擇性、高效率的手性

分離

疏水作用親和色譜法利用在水溶液中非極性基團之不同的蛋白質(zhì)和核酸

間的接觸結(jié)合的親和作用

2.親和色譜分離技術(shù)要素

在親和色譜分析中，分離、純化對象大多為極性生物活性分子，但從固定相上把它們

洗脫下來時，需要用pH值接近于中性的稀緩沖液，以保持其生物活性。生物分子和各種親

和配位體生成的配合物一般穩(wěn)定常數(shù)不大，而且可逆，因此在大多數(shù)情況下使用非選擇性洗

脫劑可實現(xiàn)不同組分的分離。但當(dāng)親和作用特別強時，必須采用特效性洗脫劑或特殊洗脫方

法，即使用含有特定組分、具有超強洗脫能力的流動相進行洗脫。

（1）.影響洗脫的幾種因素

1）.鎖鑰絡(luò)合物的離解常數(shù)

鎖鑰絡(luò)合物越穩(wěn)定，離解常數(shù)KD越小，一般KD大于10‘mol/L時，親和力太弱，無

法用于分離；當(dāng)KD在10"~l（y3mol/L之間，鎖鑰絡(luò)合物呈現(xiàn)可逆吸附，親和作用力強度適

用于分離；當(dāng)小于IO-5mol/L,生物分子被牢固吸附，必須改變外界條件才能分離；當(dāng)

KD小于lO^mol/L時;親和性很高，洗脫可能極端困難，僅當(dāng)在變性條件下才能實現(xiàn)洗脫。

2).配體濃度

鍵合配體濃度明顯影響親和固定相的有效性。通常親和固定相制備時，其載體不需要

健合高濃度的配體，因為隨配體密度的增加，鍵合強度和非特效相互作用也隨之增大，與此

同時，由于立體阻礙，基體的有效性也會降低。在大多數(shù)情況下，配體濃度達20pmol/mL

即可，僅在低親和體系時，才使用最高可能達到的濃度。對于具有高親和性的配體，如需降

低配體的濃度或親和性，降低洗脫的難度，可簡單地將一定量載體與親和固定相混合后再裝

柱就能實現(xiàn)。

3).空間阻礙作用

當(dāng)生物活性分子與配體作用生成鎖鑰絡(luò)合物時，會遇到一系列的空間阻礙作用：a.生

物活性分子在親和固定相上的擴散受到載體孔徑和孔容的限制，因此親和固定相的載體必須

具有大孔(30nm)。如能將親和色譜與凝膠滲透色譜組合，最適合于分離既能與配體親和又

具有不同分子量的化合物。b.如將小分子配體直接鍵合在載體上，生物大分子與配體鍵合

形成鎖鑰絡(luò)合物會受到較大的空間阻礙作用，為減少立體干擾，增加小分子配體的柔韌性和

可移動性，小分子配體最好通過間隔臂再與載體偶聯(lián)。間隔臂在親和固定相中十分重要，親

和色譜的效率可借助在載體和配體之間插入不同長度的間隔臂碳鏈(大多數(shù)情況下為C6鏈)

而獲得顯著的增強。c.配體通過共價定位后，其活性作用位被其他基團阻礙，而無法與生

物活性分子相互作用，使親和作用大大降低。

4).平衡時間

在某些情況下，特效配體與生物大分子之間的吸附平衡以很慢的速度完成，一方面由

于與特效配體接觸的生物大分子數(shù)目相當(dāng)少，另一方面蛋白質(zhì)等的活性位必須緊緊對準(zhǔn)親和

配體才能實現(xiàn)特效吸附。為滿足達到吸附平衡的條件，進樣后洗脫速度應(yīng)盡可能低。對弱親

和作用，洗脫前將樣品與親和固定相平衡一段時間，不僅可增強親和作用，還可提高色譜柱

分離能力。

5).溫度效應(yīng)

親和吸附作用會隨溫度的升高而減小。在色譜過程中，隨著溫度的升高，分子遷移速

度加快，有利于洗脫過程，0~25。＜3范圍比較適合于親和色譜。

(2).親和色譜流動相的組成

親和色譜使用的流動相皆為具有不同pH的緩沖溶液，由無機和有機弱酸或弱堿與其

共軌酸堿構(gòu)成。為保持生物大分子的活性，一般在溫和條件下洗脫，pH6~8的緩沖體系較

為適合。表2-2,2-3列出了常用的緩沖物質(zhì)和Good's緩沖物的適用pH范圍。

表2-2常用的酸、堿緩沖物質(zhì)

化合物pKa(pKb)化合物pKa(pKb)

草酸1.23(pKai)琥珀酸4.19(pKai)

4.19(pKa2)5.57(pKa2)

磷酸2.12(pKa,)檸檬酸3.06(pKaj)

7.21(pKa2)4.74(pKa2)

12.32(pKa3)5.40(pKa3)

亞氨基二乙酸2.33谷氨酸4.32

天冬氨酸2.90(pKaj)碳酸鍍6.35(pKa)

5.70(pKa2)10.33(pKb)

丙二酸2.90(pKai)咪喋7.00

5.70(pKa2)

乙酸4.74麥黃酮8.05

甲酸3.74甘氨酰胺8.20

2-羥基異丁酸3.97甘氨酰甘氨酸8.25

嗎咻8.49三（羥甲基）氨基甲烷（tris）8.30

硼酸9.24氨水9.26

表2-3Good,s緩沖物的適用pH范圍

緩沖物縮寫pH值范圍

2-（N-嗎咻）乙基磺酸/NaOHMES/NaOH5.5?6.7

N-（2-乙酰胺基）亞氨基二乙酸/NaOHADA/NaOH6.0~7.2

哌嗪-N,N，-雙（2-乙基磺酸）/NaOHPIPES/NaOH6.1~7.5

N-乙酸氨基-2-氨乙基磺酸/NaOHACES/NaOH6.2~7.5

3-（N-嗎咻）丙基磺酸/NaOHMOPS/NaOH6.5~7.9

N2羥乙基哌嗪-N，2乙基磺酸/NaOHHEPES/NaOH6.8?8.2

N-三（羥甲基）甲基甘氨酸/HC1Tricine/HCl7.4~8.8

N,N-雙（2-羥乙基）甘氨酸/HC1Bicine/HCl7.6?9.0

3-[N-H（羥甲基）甲氨酸]丙基磺酸/NaOHTAPS/NaOH7.7?9.1

2-（環(huán)己氨基）乙基磺酸/NaOHCHES/NaOH8.6~10.6

3-（環(huán)己氨基）丙基磺酸/NaOHCAPS/NaOH9.7~11.1

(3).洗脫方法

1).非選擇性洗脫法

當(dāng)被分離的生物分子與配體形成穩(wěn)定常數(shù)較小的絡(luò)合物時，在恒組成洗脫條件下，使

用洗脫能力較弱的、具有不同pH值的緩沖溶液，就可使絡(luò)合物解離，而將生物分子洗脫下

來。當(dāng)被分離的生物分子除與配位體存在配位作用，還存在由于靜電引力、氫鍵力或疏水相

互作用引起的非特異性吸附時，必須通過以下幾種方法來消除非特異性吸附，而又不損害生

物分子的生物活性和固定相的穩(wěn)定性：a.改變流動相的pH值。許多類型的親和作用會在

極端的pH條件被破壞，但利用改變pH變更洗脫條件時要注意樣品分子是否會失去生物活

性。b.改變流動相的離子強度，任何具有離子基團的親和色譜固定相都會由于產(chǎn)生非特異

性吸附而影響洗脫，一般可向流動相加入高濃度NaCl(0.1~1.0mol/L)增加流動相的離子

強度，以減輕非特異性吸附，實現(xiàn)樣品分子的順利洗脫，也可采用梯度洗脫方式進行。c.改

變流動相的極性，向具有一定pH值的流動相中加入極少量的有機改性劑，如甲醇、乙盾、

四氫吠喃、乙二醇、二甲基甲酰胺等，因改變了親和作用周圍的介質(zhì)條件，會隨著疏水作用

的增強，而破壞樣品分子與配體之間的親和作用呈現(xiàn)出極有效的洗脫效應(yīng)。d.加入離子順

序試劑，如將硫氧化鉀、胭、鹽酸胭、三氯乙酸等加入流動相，會使蛋白質(zhì)等生物分子的結(jié)

構(gòu)發(fā)生變化，而破壞原已存在的親和作用。離子順序試劑實際上就是蛋白質(zhì)變性劑，使用

10mmol/L左右低濃度離液順序試劑是實現(xiàn)快速洗脫，并盡可能保持生物活性的最佳方法。

非選擇性洗脫最大優(yōu)點是使用了廉價的pH緩沖溶液作為流動相，此外還可克服非特

異性吸附。其缺點是，當(dāng)使用有機改性劑或離子順序試劑來強化洗脫條件時，常會使被分離

生物分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆變化，尤其是對高活性蛋白質(zhì)時因慎重使用。

2).特效性洗脫

當(dāng)生物分子與固定相的配體存在強親和作用時，宜采用選擇性強的特效性洗脫法，即

在流動相中添加另一種游離配體和被分離的生物活性分子相結(jié)合，而從柱上洗脫下來。洗脫

后可利用改變pH值或加入變性劑的方法，重新獲得生物分子的純品。為增加特效洗脫的純

化效果，可采用多次脈沖式加入流動相的方法進行，或采用停流洗脫方式，以增加流動相與

樣品分子的相互作用時間，保證洗脫完全。

3）.特殊洗脫方法

當(dāng)生物分子與配體間存在特別強的親和作用時，就需要使用特殊洗脫方法。在某些情

況下使用硼酸鹽緩沖溶液作為流動相會產(chǎn)生特殊有效的洗脫效果。另一種特殊洗脫方法是通

過選擇性地斷裂固定相基體和配體之間的化學(xué)鍵如偶氮鍵、二硫鍵等，而完整地將配體-蛋

白絡(luò)合物釋放出來。然后再用適當(dāng)?shù)姆椒?，如改變pH、加入疏水性有機溶劑、改性劑等，

將洗脫下來的絡(luò)合物中的蛋白質(zhì)離解出來，并用配體重新再生固定相。這種方法特別適用于

對配體親和力特別強，且又需純化的生物大分子樣品。

（4）.親和色譜固定相

親和色譜固定相是親和色譜法對生物大分子實現(xiàn)高效分離的關(guān)鍵，其制備方法比一般

色譜固定相復(fù)雜，由載體（support,又稱基體matrix）、間隔臂（spacer或spacerarms）和

配體（ligand,又稱底物substrate）三部分組成。

載體應(yīng)適用于色譜分析，一般用無機氧化物如SiO2,AI2O3、Zr02等，生物聚合物如

瓊脂糖、葡聚糖等或高分子聚合物如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸

酯等。間隔臂大多數(shù)為線性的脂肪族有機物，具有雙官能團，一端與載體連接，另一端與配

體連接。間隔臂的長度直接影響固定相的立體效應(yīng)，可具有疏水性或親水性，也可由多肽或

蛋白大分子構(gòu)成，不僅可為直線形，還可構(gòu)成星形輻射樹枝狀。配體應(yīng)呈現(xiàn)對一系列生物分

子的特效性，自身須具有能和間隔臂共價鍵連接的官能團。

親和色譜固定相的制備，實際上就是在固相載體上進行特定化學(xué)官能團的固定化反

應(yīng)，一般有順序鍵合法和分步鍵合法兩種方式。不論采用哪種方式進行固化反應(yīng)，其偶聯(lián)反

應(yīng)條件必須十分溫和，并對反應(yīng)物不會產(chǎn)生有害的影響，特別對易變性的生物特效配體。

親和色譜固定相的制備中，不僅涉及有機合成，還涉及到表面化學(xué)領(lǐng)域。常用于對固

定相制備過程進行表征和檢驗的分析技術(shù)有三類：a.測定經(jīng)化學(xué)鍵合偶聯(lián)在載體上的間隔臂

或配體的特征官能團或化學(xué)組成。如紫外吸收光譜（UV）、紅外吸收光譜（IR）、拉曼光譜、

核磁共振波譜（NMR）以及使用軟電離技術(shù)的質(zhì)譜（MS）；b.測定固相表面結(jié)構(gòu)特性及試劑

在固相表面分散情況的表面分析技術(shù)，如X射線光電子能譜（XPS）、俄歇電子能譜（AES）、

X射線衍射（XRD）、掃描電子顯微鏡（SEM）：c.其他分析方法，如測定固相含水量、熱

穩(wěn)定性、分解或相變溫度的熱分析方法（DTA、DSC等）以及用化學(xué)分析法分析固相的表

面積、酸堿活性作用位點、配體鍵合容量等。

3.親和色譜分析實驗技術(shù)

親和色譜分析操作技術(shù)可分為小型柱重力洗脫、低中壓液相色譜分析和高效液相色譜

分析三種操作方式。

（1）.小型柱重力洗脫

由瓊脂糖、葡聚糖等軟質(zhì)凝膠制備的親和色譜固定相，常用于小型柱重力洗脫。對具

有高特異性親和吸附的固定相，不一定使用色譜柱操作，可采用“分批吸附法”，即將親和

性極高的特異性親和固定相勻漿加入到生物樣品粗制品中，可從含有大量惰性蛋白質(zhì)的混合

物中，將少量特異性蛋白質(zhì)提取出來。也可采用小型色譜柱裝填具有特異性親和固定相，將

生物樣品粗制品加入色譜柱，用適當(dāng)流動相沖洗掉未被吸附的惰性蛋白質(zhì)，而將特異性蛋白

質(zhì)保留在小型色譜柱中。

小型色譜柱（見圖2-8）通?？扇菁{5mL體積的軟質(zhì)凝膠固定相。小型柱除可用于色

譜分離外，還可在小柱中進行偶聯(lián)、鍵合反應(yīng)。即先把載體裝柱，加入偶聯(lián)或鍵合劑，將小

柱密封，搖蕩柱子使凝膠處于懸浮狀態(tài)，就可對載體進行活化，偶聯(lián)或鍵合反應(yīng)，只要反應(yīng)

液不損壞小柱的結(jié)構(gòu)，可反復(fù)多次利用。

圖2-8小型柱結(jié)構(gòu)

（2）.低、中壓液相色譜分析

多糖類軟質(zhì)凝膠親和色譜固定相也可裝填在內(nèi)徑1~2cm、嵌25~50cm的色譜柱中,

凝膠固定相用水溶脹后再進行裝填，流動相置于柱頂溶劑貯罐中利用重力洗脫，也可采用柱

頂通入0.1~0.25MpaN,或?qū)χ┒诉M行抽真空的方法來加速洗脫。

對商品提供的多糖凝膠柱，可在專用的低、中壓液相色譜儀上使用，可用于分析測定,

也可用于制備。其儀器流路如圖2-9所示。

圖2-9低、中壓親和色譜結(jié)構(gòu)

中壓液相色譜系統(tǒng)可快速實現(xiàn)多肽、蛋白質(zhì)、多核甘酸的分離、制備任務(wù)，是專門為

生物化學(xué)家需要而研制的。

（3）.高壓液相色譜分析

隨全多孔單分散大孔硅膠的廣泛應(yīng)用，高效親和色譜固定相的種類也越來越多，高壓

液相技術(shù)也更多地應(yīng)用于親和色譜。在進行高壓液相親和色譜分析時，生物樣品非常復(fù)雜，

為提高分離的選擇性，常使用具有不同pH值的緩沖體系。為加速洗脫，也會在流動相中加

入高濃度的NaCl,或添加硫眼、尿素、KSCN等離子試劑或表面活性劑，這些改性劑、變

性劑、表面活性劑的加入，會對以不銹鋼為主體材料的高壓液相色譜系統(tǒng)產(chǎn)生腐蝕，而溶出

的金屬離子可能會引起生物分子的失活，因此要求應(yīng)用于高壓液相親和色譜分析生物樣品的

儀器應(yīng)為“全惰性”的HPLC系統(tǒng)。

（4）.生物樣品的制備和保存

在親和色譜分析中使用大量生物樣品，在制備親和色譜固定相時也要使用多種生物分

子作配體，因此正確保存生物樣品或生物制劑，或從生物活體制備所需的蛋白質(zhì)、多肽、酶、

核糖核酸、抗體、多糖、脂類等是親和色譜分析中的一種重要環(huán)節(jié)。

生物樣品或制劑的質(zhì)量會受到保存環(huán)境外界條件的影響，如空氣氧化、溫度變化、日

光輻射、空氣濕