蔬菜品質(zhì)基因工程及分子標(biāo)記輔助育種

蔬菜品質(zhì)基因工程

調(diào)控抗壞血酸合成代謝基因提高維生素C含量超量表達(dá)GMP基因提高番茄果實(shí)抗壞血酸含量GMP果實(shí)VC含量ZhangCJetal.,2011;2013超量表達(dá)MIOX基因提高番茄果實(shí)抗壞血酸含量果實(shí)VC含量Unpublisheddata超量表達(dá)GalUR基因提高番茄果實(shí)抗壞血酸含量Unpublisheddata抑制APX表達(dá)，提高番茄果實(shí)抗壞血酸含量抗壞血酸含量APX酶活性ZhangYYetal.,2011RNAi抑制AO酶活性，提高果實(shí)抗壞血酸積累抗壞血酸含量AO酶活性ZhangYYetal.,2011通過基因工程延長蔬菜貯藏期目前主要通過兩種途徑來延長蔬菜存貯期通過抑制多聚半乳糖醛酸酶（PG）的活性來抑制細(xì)胞壁果膠的降解，使果實(shí)抗軟化通過抑制乙烯生成，提高果實(shí)耐受“成熟過度”的能力反義抑制聚半乳糖醛酸酶，減少果實(shí)細(xì)胞壁降解，提高番茄耐貯性反義抑制ACO基因，減少乙烯釋放量，提高番茄果實(shí)耐貯性將反義ACO基因?qū)敕?，抑制果?shí)中乙烯釋放，獲得遲熟轉(zhuǎn)基因番茄，再結(jié)合雜種優(yōu)勢育種，培育成一代雜種——“華番1號(hào)”。1997年通過農(nóng)業(yè)部基因工程安全委員會(huì)審批，1998通過品種審定，成為我國第1個(gè)獲得農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)上市的轉(zhuǎn)基因植物品種。轉(zhuǎn)基因蔬菜現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因蔬菜研究進(jìn)展迅速，促進(jìn)基礎(chǔ)研究生物安全性顧慮導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究進(jìn)展偏慢利用生物技術(shù)和分子生物學(xué)手段，嘗試非轉(zhuǎn)基因途徑，用于蔬菜遺傳改良二.蔬菜分子標(biāo)記輔助育種標(biāo)記開發(fā)連鎖標(biāo)記基因標(biāo)記（功能標(biāo)記）分子標(biāo)記輔助選擇基因基因附近的DNA標(biāo)記功能標(biāo)記連鎖標(biāo)記蔬菜種質(zhì)資源評價(jià)基因定位分子標(biāo)記輔助選擇種子純度鑒定分子標(biāo)記在蔬菜中應(yīng)用蔬菜作物標(biāo)記的性狀標(biāo)記/基因的代號(hào)引物序列（正向FW、反向RV）PCR（bp）標(biāo)記類型PCR退火℃參考資料辣椒抗病毒基因（細(xì)菌性斑點(diǎn)）PepC2FV:TTGAAAAGGTTATCAATCATGGAARV:TCATCCCACAATCTTTTGAGC358

C.Eduardo,2010抗CMV病毒基因CaTm-int3HRMFV：TGGTGTTTTTATCAGCCTTAGCRV：GAAGGACAAGAATTCATGATATGG158

57Won-Hee,2010抗CMV病毒基因CaT1616BACFV:AATTGGTTCTGGATCACTGCCRV:CACCTTGATCTGCTCCTTTCTG200

57Won-Hee,2010抗CMV病毒基因240H02sp6FV:TTGGTTGAGGCAAGTTTTCARV:TCATTTTCCTATGTCATTCATGG472

57Won-Hee,2010茸毛基因HpmsE031FV:CCCTAAATCAACCCCAAATTRV:CCCCCATTACCTGACTGCAA167共顯性50~56Hyun,2010茸毛基因TscaFV:AAACGCCATCATTCGTTTTCRV:CATGAAAGTTGACCCGAACA356共顯性54~55Hyun,2010茸毛基因Tco-1FV:TCATTTTCCATACCTATACACCRV:TCAGTCAAACTAGACAGCAGATCC300共顯性47~54Hyun,2010抗根結(jié)線蟲基因E39/M41-339FV:ATTCAGAAAAAGACTTGGAAGGRV:TAAAGGGATTCATTTTATGCATAC315共顯性57L.H.Wanga,2009蔬菜作物重要性狀的分子標(biāo)記蔬菜作物重要性狀的分子標(biāo)記蔬菜作物標(biāo)記的性狀標(biāo)記/基因的代號(hào)引物序列（正向FW、反向RV）PCR產(chǎn)物（bp）標(biāo)記類型（顯性或共顯性）PCR退火℃參考資料茄子抗青枯病

FW:GACTGCGTACCAATTCAGTTRV:GATGAGTCCTGAGTAACACGATG762SCAR顯性36曹必好

抗鐮刀霉枯萎病Me8/Em5FW：TGAGTCCAAACCGGACTRV：GACTGCGTACGAATTAAC426SRAP共顯性50NedimMutlu等2008

抗鐮刀霉枯萎病Em12/GLPL2FW：GACTGCGTACGAATTCTCRV：CA(AT)AG(AC)AA(AG)(AT)GG(AGC)A(AG)(AT)CC360SRAP-RGA顯性55NedimMutlu等2008

抗青枯病E42M48E42：GACTGCGTACCAATTCAGTM48：GATGAGTCCTGAGTAACAC320AFLP顯性56高玉梅（2006）

單性結(jié)實(shí)E75/M53E75：GACTGCGTACCAATTCGTAM53：GATGAGTCCTGAGATAACCG70AFLP顯性56萬翔(2006)

與果皮顏色相關(guān)的基因E10M19-1FW：GATGAGTCCTGAGTAACGGRV：GCTGAATTGGTACGCAGTC108AFLP共顯性56孫保娟（2009）1.基因序列收集基因基因登記號(hào)功能注釋Tm-2aAF536201煙草花葉病毒抗性tm-2AF536199I-2AF118127番茄枯萎病抗性Cf-9AJ002236葉霉病抗性Cf-0AY639604Mi-1U81378根結(jié)線蟲抗性mi-1CDQ863290蔬菜分子標(biāo)記開發(fā)及分子標(biāo)記輔助選擇（以抗病基因?yàn)槔?.引物設(shè)計(jì)針對SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)，引物3’端與模板互補(bǔ)或錯(cuò)配，并人為的在3’端的第二或第三位引入錯(cuò)配堿基?；蛘哚槍π∑蔚娜笔Ш筒迦?，將引物設(shè)計(jì)在缺失或插入片段兩側(cè)。Tm-2a基因SNP分析Tm-2a

引物（多態(tài)性：有無差異）A1:5’-GCCTCATTCAACTTCCTTCTGG-3’A2:5’-GCCAGTATATAACGGTCTAAAC-3’Cf-9引物

（多態(tài)性：有無差異）C1:5’-GTTCTTATCCTTTAACACCCA-3’C2:5’-TCCCTCCAAATTATTACTTCC-3’I-2引物

（多態(tài)性：大小差異）B1:5’-CCATCTCTCAAGGAACTGCGTC-3’B2:5’-GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA-3’Mi-1引物

（多態(tài)性：大小差異）D1:5’-TTCTCTAGCTAAACTTCAGCC-3’D2:5’-TTTTCGTTTTTCCATGATTCTAC-3’3.等位基因特異PCR引物1）Tm-2a特異引物PCR檢測與接種鑒定1234567CKM500bp接種煙草花葉病毒幼苗A:A53（感）B:LA1221（抗）1-6:A111、A114、A53、A115、A113；7:LA1221（抗）；CK：空白對照；M：MarkerTm-2a特異引物對不同番茄品系基因組的PCR檢測AB4.抗病基因標(biāo)記的驗(yàn)證標(biāo)記的有無差異：抗性基因型擴(kuò)展出片段2）Mi特異引物PCR檢測與接種鑒定AB圖A:接種前幼苗；B:接種后植株；C1：LA2819（抗）；C2：A53（感）12MLA2819A53LA2819A53C標(biāo)記的大小差異：抗性基因型擴(kuò)展出較小片段3）葉霉菌抗性標(biāo)記檢測及接種鑒定7份番茄材料是目前國內(nèi)外通用的含不同抗葉霉病基因的品系。MCK1234567500bpCf-9特異引物在7份材料中的PCR檢測1-7:Ont7719（抗），Ont7717、V121、Ont7516、Vetomold、Leafmouldresister、Moneymaker；CK：空白對照；M：Marker標(biāo)記的有無差異：抗性基因型擴(kuò)展出片段CK12345678M750bp500bp4)I-2抗枯萎病特異引物PCR檢測1-6:A53、A101、A57、A111、A104、A103；7-8：LA3847（抗）、LA4026（抗）標(biāo)記的大小差異：抗性基因型擴(kuò)展出較小片段（1）基因標(biāo)記選擇F3代分離群體的三抗植株對引進(jìn)抗病F2進(jìn)行2-3代自交，自交過程中以基因特異引物對分離后代的單株進(jìn)行基因標(biāo)記輔助選擇，選擇對象為三抗性植株（TMV-2a,Mi-1，I-2）。5.蔬菜抗性基因標(biāo)記輔助育種

500bp1）番茄F3材料Tm-2a的PCR分析（有無差異）1：LA1221(抗）；2：A53（感）；3-20：3275F3單株750bp2）番茄F3材料I-2的PCR分析（大小差異）1：A6（感）；2：LA4026（抗）；3-21：3275單株；CK：空白對照；M：Marker600bp1000bp750bp3）番茄F3材料Mi-1的PCR分析（大小差異）

ck1：LA2819(抗）；ck2：A6(感）；1-22：3275單株；M：marker4）利用分子標(biāo)記輔助選擇對F3～F4的單株檢測結(jié)果植株編號(hào)PCR檢測抗病基因標(biāo)記綜合鑒定的植株抗病情況Tm-2aI-2Mi-13-12-1+-+2抗3-12-2+++3抗3-12-3+++3抗3-12-4+--1抗3-12-5++-2抗3-12-6+++3抗3-12-7+++3抗3-12-8+++3抗3-12-9+++3抗3-5-10+--1抗3-12-11+++3抗3-12-12+++3抗3-12-13+++3抗3-12-14+++3抗3-12-15+-+2抗植株編號(hào)PCR檢測抗病基因標(biāo)記綜合鑒定的植株抗病情況Tm-2aI-2Mi-13-12-8-1+++3抗3-12-8-2+++3抗3-12-8-3+++3抗3-12-8-4+++3抗3-12-8-5+++3抗3-12-8-6+++3抗3-12-8-7+++3抗3-12-8-8+++3抗3-12-8-9+++3抗3-12-8-10+++3抗3-12-8-11+++3抗3-12-8-12+++3抗3-12-8-13+++3抗3-12-8-14+++3抗3-12-8-15+++3抗3-12-8-16+++3抗3-12-8-17+++3抗3-12-8-18+++3抗3-12-8-19+++3抗3-12-8-20+++3抗自交篩選（2）聚合四抗植株的標(biāo)記輔助選擇

(Tm-2a,I-2,Mi-1,Cf-9)雜交聚合四抗性材料的PCR檢測，以4個(gè)基因標(biāo)記分別對雜交聚合的22個(gè)單株基因組進(jìn)行PCR檢測。檢測結(jié)果顯示9個(gè)單株已經(jīng)聚合了四種抗病基因（Tm-2a+Cf-9+I-2+Mi-1）四個(gè)基因純合株系與親本苗期接種鑒定自交系TMVI-2Mi-1Cf-9L18HR（0.71）HR（2.19）R（4.30）R（5.36）L19HR（1.32）HR（2.01）R（5.42）HR（1.70）L20R（2.60）HR（3.66）R（5.56）HR（2.70）L21HR（096）HR（2.87）R（6.77）HR（1.42）#3275HR（1.65）HR（3.31）R（8.19）S（59.82）JF-18S（52.36）S（61.68）S（56.32）HR（2.12）注：HR：高抗；R：抗；S：感；（）：病情指數(shù)；Note:HR:Highresistance;R:Resistance;S:Susceptible;（）:Diseaseindex受體親本×供體親本A(無優(yōu)異基因)(含優(yōu)異基因A)受體親本×供體親本B(無優(yōu)異基因)(含優(yōu)異基因B)

F1(含優(yōu)異基因A)×F1(含優(yōu)異基因B)復(fù)雜雜種(分離群體)受體親本×供體親本C(無優(yōu)異基因)(含優(yōu)異基因C)中選雜種個(gè)體×F1(含優(yōu)異基因A和B)(含優(yōu)異基因C)復(fù)雜雜種(分離群體)中選雜種個(gè)體×受體親本(含優(yōu)異基因A、B和C)新育成的優(yōu)異品種

(受體親本遺傳背景+優(yōu)異基因A、B和C)回交1~2代，標(biāo)記輔助選擇自交標(biāo)記輔助選擇標(biāo)記輔助選擇分子標(biāo)記輔助基因聚合含純合Ty1位點(diǎn)（抗性）的株系會(huì)產(chǎn)生402、31bp的帶，含純合ty1位點(diǎn)的植株（感?。﹦t會(huì)出現(xiàn)31、47、354bp的帶，含Ty1/ty1位點(diǎn)的株系（雜合抗性）則會(huì)出現(xiàn)402、354、47、31bp的條帶。（3）新病害的標(biāo)記開發(fā)檢測（番茄黃化曲葉病毒）Ty-1位點(diǎn)檢測Ty-1CAPS標(biāo)記CAPS1F：5'-TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT-3'CAPS1R：5'-CGGATGACTTCAATAGCAATGA-3'純合感病純合抗病雜合抗病用引物TYF5/TYR6擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物Ty-3/Ty-3基因型擴(kuò)增出一條450bp的條帶；Ty-3/ty-3基因型的材料擴(kuò)增出450bp和320bp的兩條帶。33:07-026；34:07-026x7898C-0；35:07-026x9179；36:07-026x7818D-1；48:9179，43、44、45、46、47和48是感病對照Ty-3SCAR標(biāo)記TYF5：5’-GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC-3’TYR6：5’-GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC-3’450bp320bpM123456789101112131415161718192021222324M252627282930313233343536373839404142434445464748雜合抗病純合抗病純合感病材料：華番2號(hào)(F1)、Tov-2-11-8-1(母本)、A5（父本）華番3號(hào)(F1)、Tov-1-25-5-2(母本)、A101(父本)SSR引物:45對

6.DNA標(biāo)記鑒定蔬菜品種指紋圖譜華番2號(hào)及親本中SSR檢測的等位基因數(shù)引物名稱等位基因數(shù)所在染色體正向引物

反向引物SSR20212GAGGACGACAACAACAACGAGACATGCCACTTAGATCCACAAW12132CAGACTGTGACAAGGCTGATTCGCATGAATAGCTGAGCAGATTGATCGSSR4746TCCTCAAGAAATGAAGCTCTGACCTTGGAGATAACAACCACAASSR23749GTGGTAACGGCAAAGGGACTCTTATGGCCTTAGCAGCCAG平均3.3第一步：篩選在親本之間差異的SSR標(biāo)記第二步：驗(yàn)證SSR標(biāo)記在F1雜種中的多態(tài)性華番3號(hào)及其親本中SSR檢測的等位基因數(shù)引物名稱等位基因數(shù)所在染色體正向引物

反向引物SSR237