羊李斯特菌病診斷技術(shù)

羊李斯特菌病診斷技術(shù)1范圍本文件規(guī)定了羊李斯特菌病的臨床診斷、病理學(xué)診斷和實驗室診斷的技術(shù)要求。本文件適用于羊李斯特菌病的診斷。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文件必不可少的條款。其中，凡是注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.30食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗GB19489實驗室生物安全通用要求。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1李斯特菌病listeriosis由李斯特菌引起人和動物的一種重要的人獸共患傳染病，呈散發(fā)或暴發(fā)發(fā)生，主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和懷孕母羊流產(chǎn)。3.2李斯特菌溶血素OlisteriolysinO,LLO單核細(xì)胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的主要毒力因子，對真核細(xì)胞膜具有裂解活性。4臨床診斷單核細(xì)胞增生李斯特菌引起羊李斯特菌病的臨床癥狀為腦膜腦炎、敗血癥和流產(chǎn)。發(fā)病初期，羊體溫升高1℃～2℃，采食、咀嚼、吞咽困難，頭頸呈一側(cè)性麻痹，彎向?qū)?cè)，做轉(zhuǎn)圈運(yùn)動。角弓反張，昏迷臥于一側(cè)，直至死亡。病程短的2d～3d，長的1至3周或更長時間。妊娠母羊流產(chǎn)，羔羊常發(fā)生急性敗血癥而很快死亡。伊氏李斯特菌引起羊李斯特菌病的臨床癥狀為胃腸炎、新生羊敗血癥和懷孕母羊流產(chǎn)，罕見病例呈腦膜腦炎相關(guān)的臨床表現(xiàn)。5病理診斷5.1眼觀病變眼觀病變表現(xiàn)如下：a）神經(jīng)癥狀的病羊：腦及腦膜充血、水腫，腦脊液增多，稍渾濁；b）敗血癥型的病羊：肝臟呈多灶性壞死，脾臟腫大，心外膜下出血；c）流產(chǎn)母羊：有胎盤炎，子宮內(nèi)膜和胎盤充血及廣泛壞死。5.2組織病理學(xué)變化 血液中白細(xì)胞總數(shù)升高，單核細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞灶及其鄰近的血管周圍呈套袖現(xiàn)象，占主導(dǎo)的細(xì)胞是淋巴細(xì)胞、組織細(xì)胞、漿細(xì)胞；腦干嗜中性粒細(xì)胞液化。6實驗室診斷6.1細(xì)菌學(xué)診斷6.1.1細(xì)菌分離和培養(yǎng)無菌采取病羊的腦脊髓液、腦、肝、脾、心、肺和腎組織，置于放有冰袋的采樣箱中（溫度低于10℃）于24h之內(nèi)運(yùn)回實驗室，直接涂片鏡檢，取樣品直接接種到科瑪嘉平板上于37℃培養(yǎng)24h，同時按照附錄A的方法進(jìn)行增菌和鑒定；或按照GB4789.30推薦的方法進(jìn)行增菌，轉(zhuǎn)接到牛津瓊脂平板上，放置在37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)至24h和48h檢查細(xì)菌培養(yǎng)情況。6.1.2菌落形態(tài)及革蘭氏染色菌落形態(tài)：李斯特菌在腦心浸液平板上培養(yǎng)24h后，形成直徑約為1mm～2mm的乳白色菌落，邊緣整齊、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起（附錄A中圖A.1）。在科瑪嘉培養(yǎng)基上形成的菌落呈藍(lán)綠色，菌落周圍有白色暈環(huán)（見附錄A中圖A.2）。在含七葉苷的瓊脂培養(yǎng)基（如MOX平板）上形成的菌落呈黑色（見附錄A中A.3）。革蘭氏染色鏡檢：革蘭氏染色陽性的小桿菌，兩端鈍圓，排列成“V”型或并列排成柵欄狀。6.1.3生化特性根據(jù)菌落特征選取5個菌落，觀察細(xì)菌形態(tài)及在血瓊脂上培養(yǎng)后的溶血活性，測定細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖及水解七葉苷的能力。單核細(xì)胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的生化特征如表1所示。表1李斯特菌的生化特征菌種葡萄糖麥芽糖甘露醇鼠李糖木糖七葉苷β-溶血反應(yīng)協(xié)同溶血反應(yīng)單核細(xì)胞增生李斯特菌++-+*-++-**伊氏李斯特菌++---+++****血清型4h的單核細(xì)胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖**血清型4h的單核細(xì)胞增生李斯特菌協(xié)同溶血反應(yīng)呈陽性***在劃線有馬紅球菌的血平板上呈鏟型溶血（見附錄A中圖A.4）6.1.4毒力鑒定將強(qiáng)毒菌株以1106CFU腹腔注射小鼠后，小鼠14天內(nèi)死亡。小鼠脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、肺臟、腎上腺、心肌、胃腸道中有較小的壞死灶。取心血、肝、脾直接做涂片，鏡檢出現(xiàn)大量呈“V”型或柵欄狀的革蘭氏陽性桿菌。6.2分子生物學(xué)診斷挑取細(xì)菌的菌落作為PCR的模板，用屬特異性引物PCR擴(kuò)增出370bp的條帶判定為李斯特菌屬；用單核細(xì)胞增生李斯特菌特異性引物PCR擴(kuò)增出660bp的條帶判定為單核細(xì)胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌特異性引物PCR擴(kuò)增出1100bp的條帶判定為伊氏李斯特菌（附錄B）。6.3血清學(xué)診斷以李斯特菌溶血素O作為包被抗原、羊血清樣品作為第一抗體、酶標(biāo)兔抗羊IgG作為第二抗體，建立間接ELISA檢測的血清學(xué)方法，應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查，具體操作和判定方法見附錄C。7結(jié)果判定綜合臨床診斷、病理學(xué)診斷及實驗室診斷結(jié)果，報告羊是否發(fā)生李斯特菌病?；疾游锉憩F(xiàn)神經(jīng)癥狀、敗血癥或流產(chǎn)、體溫升高，血液中單核細(xì)胞增多，可疑為李斯特菌病。進(jìn)一步從病死羊中分離鑒定出單核細(xì)胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌，可以確診；若未分離到李斯特菌，但患病一周后的羊血清間接ELISA測定結(jié)果陽性，也判定羊患有李斯特菌病。8安全措施按照GB19489執(zhí)行。附錄A（規(guī)范性）李斯特菌的分離與鑒定取10g固體樣品或10mL液體樣品（包括血液樣品）放入90mLLEB增菌液中（紗布、棉簽直接放入），30℃培養(yǎng)16h。然后用接種環(huán)取培養(yǎng)液在科瑪嘉顯色平板上劃線，37℃培養(yǎng)24h。選取帶白色暈環(huán)的藍(lán)綠色菌落在腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）平板上純化培養(yǎng)，單菌落用于后期的進(jìn)一步鑒定。圖A.1腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）上的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌落圖A.2科瑪嘉平板上的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌落

圖A.3MOX平板上的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌落圖A.4血平板上的李斯特菌與馬紅球菌的協(xié)同溶血試驗（圖A1、A.3和A.4為伊氏李斯特菌；圖A.2為單核細(xì)胞增生李斯特菌）

附錄B（規(guī)范性）PCR方法鑒定李斯特菌引物李斯特菌屬鑒定引物：擴(kuò)增產(chǎn)物長度為370bp單核細(xì)胞增生李斯特菌鑒定引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為660bp伊氏李斯特菌鑒定引物擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1100bpB.2.1以細(xì)菌的基因組為模板，利用引物PseF和PseR首先對分離菌株進(jìn)行李斯特菌屬的鑒定。PCR反應(yīng)體系（50μL）：超純水34.6μL，10×Buffer（含Mg2+）5μL，dNTP4μL，rTaq酶0.4μL，上下游引物各2μL，模板2μL；PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃50s，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。B.2.2反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，分離株鑒定為李斯特菌屬后，繼續(xù)用2種引物（MonoA和LisB）和（Ival和LisB）分別進(jìn)行種鑒定，PCR反應(yīng)體系如下：超純水27.75μL10×PCR緩沖液5μLdNTP(2.5mM)5μLMonoA、各2μLLisB4μLrTaqDNA聚合酶0.25μLDNA模板4μL總的反應(yīng)體系50μLB.2.3在對李斯特菌進(jìn)行若以菌落為模板做PCR，則DNA模板體積為0，以超純水補(bǔ)齊不足部分的反應(yīng)體系。細(xì)菌的加入方法為：用滅菌牙簽挑取菌落，轉(zhuǎn)移至加有50μL反應(yīng)混合液的PCR管中與管壁輕輕摩擦和攪動。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃50s，58℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。B.2.4反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。反應(yīng)的體系與條件參照李斯特菌屬鑒定，其中退火反應(yīng)設(shè)為58℃，1min。用屬鑒定引物PCR擴(kuò)增出370bp的條帶判定為李斯特菌屬；用單核細(xì)胞增生李斯特菌鑒定引物PCR擴(kuò)增出660bp的帶判定為單核細(xì)胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌鑒定引物PCR擴(kuò)增出1100bp的條帶判定為伊氏李斯特菌。若擴(kuò)增出370bp左右的條帶，則對應(yīng)菌株鑒定為李斯特菌屬的細(xì)菌，如圖B.1泳道1和2所示。在擴(kuò)增出李斯特菌屬特異性條帶的前提下，若擴(kuò)增出660bp的條帶，如圖B.2第1泳道所示，則為單核細(xì)胞增生李斯特菌；若擴(kuò)增出1100bp的條帶，如圖B.2第2泳道所示，則為伊氏李斯特菌。圖B.1李斯特菌屬鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果圖B.2單核細(xì)胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌種PCR擴(kuò)增結(jié)果附錄C（規(guī)范性）間接ELISA方法檢測抗LLO的血清抗體C.1用0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液將LLO蛋白稀釋，包被于96孔板中，包被量為0.5μg/孔，于4℃過夜吸附。C.2次日用PBST洗滌3次~5次，每次5min，拍干。C.3然后用1%BSA封閉，每孔200μL，37℃作用2h，洗板同上。C.4加入待檢血清（用PBST1:400稀釋），每孔100μL，同時設(shè)立陰、陽性對照孔，37℃作