朱明華版儀器分析HPLC

高效液相色譜簡(jiǎn)介（HPLC）是以氣相色譜為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上，采用顆粒十分細(xì)的固定相，并采用高壓泵輸送流動(dòng)相而建立的一種液相色譜法。HPLC的突出特點(diǎn)：

1）高壓;2）高速;3）高效;

4）高靈敏度(10-9);

5）高選擇性;HPLC的應(yīng)用范圍：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測(cè)，用途廣泛，占有機(jī)物的80%。GC與LC的比較HPLC

系統(tǒng)溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵樣品引入系統(tǒng)：自動(dòng)購(gòu)置進(jìn)樣器樣品分離系統(tǒng)：關(guān)鍵色譜柱信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)：檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：軟件泵的基本原理（高壓泵.swf）往復(fù)活塞泵(單向閥)彈簧隔板/紅寶石球串聯(lián)柱塞泵消除流量脈沖

并聯(lián)柱塞泵減小流量脈沖

儀器：手動(dòng)進(jìn)樣器-六通閥/定量環(huán)（LC.swf）六通閥定量環(huán)高壓定量進(jìn)樣閥：高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置。優(yōu)點(diǎn)：進(jìn)樣準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適于定量分析。儀器：自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣100樣品盤(pán)/機(jī)器手/自動(dòng)洗針機(jī)械手樣品盤(pán)色譜柱：柱溫箱、色譜柱外掛架柱溫箱外掛架儀器：檢測(cè)器-紫外UV/Vis雙燈，全波長(zhǎng)檢測(cè)ＤＡＤ檢測(cè)器流路儀器：檢測(cè)器-其它儀器：化學(xué)工作站進(jìn)樣器高壓泵流動(dòng)相色譜柱檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理流動(dòng)相HPLC流動(dòng)相除了起運(yùn)載作用外，還直接參與分離，影響明顯。鹽的影響：通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無(wú)機(jī)鹽使流動(dòng)相表面張力增大，對(duì)非離子性溶質(zhì)，使k增加，對(duì)離子型溶質(zhì)，k下降。對(duì)堿性有機(jī)物有改善峰形的作用。pH值：加入酸、堿或緩沖液，控制PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。流動(dòng)相單組分（一種溶劑）和多組分；極性、弱極性、非極性；固定組成洗脫和梯度洗脫；用二元或三元組合溶劑靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。無(wú)水正庚烷含水正庚烷水飽和正庚烷色譜柱C18流動(dòng)相常用作流動(dòng)相的溶劑有：乙腈、甲醇、乙腈–

水、甲醇-水、四氫呋喃、氯仿、正己烷等。乙腈的毒性、成本均高于甲醇，在等度淋洗時(shí)一般選用甲醇-水體系。乙腈-水比較適合梯度洗脫，而甲醇-水系統(tǒng)出于熱力學(xué)和可壓縮性因素，在梯度洗脫時(shí)易導(dǎo)致基線漂移。梯度洗提(脫)梯度洗脫即程序控制流動(dòng)相的組成，使在整個(gè)分離過(guò)程中，溶劑強(qiáng)度按照特定的變化規(guī)律增加。優(yōu)點(diǎn)：分離復(fù)雜混合物，使所有組分都處在最佳的k值范圍內(nèi)。缺點(diǎn)：檢測(cè)器的使用受到限制，分析結(jié)果的重復(fù)性取決于流速的穩(wěn)定性。柱子需進(jìn)行再生處理。與氣相色譜中的程序升溫相當(dāng)對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相

normalphase色譜），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相

reversephase色譜）。為什么？化學(xué)鍵合相色譜優(yōu)點(diǎn)：有較好的分離效果；缺點(diǎn)：固定液流失，使柱效和分離選擇性下降產(chǎn)生基線噪聲而降低檢測(cè)器的靈敏度。不適用于梯度洗脫操作。***化學(xué)鍵合相色譜法***為了解決固定液的流失問(wèn)題，人們將各種不同的有機(jī)官能團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)共價(jià)鍵合到硅膠(載體)表面的游離羥基上，而生成化學(xué)鍵合固定相，并進(jìn)而發(fā)展成鍵合相色譜法。特點(diǎn)：化學(xué)鍵合固定相對(duì)各種極性溶劑都有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。由它制備的色譜柱柱效高、使用壽命長(zhǎng)、重現(xiàn)性好，幾乎對(duì)各種類型的有機(jī)化合物都呈現(xiàn)良好的選擇性，特別適用于具有寬范圍k值的樣品的分離，并可用于梯度洗脫操作。根據(jù)鍵合固定相與流動(dòng)相相對(duì)極性的強(qiáng)弱，該法分為正相鍵合相色譜法和反相鍵合相色譜法。在前者中，鍵合固定相的極性大于流動(dòng)相的極性，適用于分離油溶性或水溶性的極性和強(qiáng)極性化合物。在后者中，鍵合固定相的極性小于流動(dòng)相的極性，適于分離非極性、極性或離子型化合物。據(jù)統(tǒng)計(jì)在高效液相色譜法中，約70％——80％的分析任務(wù)皆由反相鍵合相色譜法來(lái)完成的。反相HPLC極性:固定相<流動(dòng)相固定相-非極性流動(dòng)相(甲醇,乙腈,THF,二氯乙烷)-極性非極性物質(zhì)后出峰正相HPLC 極性:固定相>流動(dòng)相固定相-極性流動(dòng)相(己烷,庚烷)-非極性極性物質(zhì)后出峰正相色譜20%反相色譜80%正相色譜20%反相色譜80%正己烷/異丙醇（v/v）：70/30；80/20；90/10；95/5正相HPLC為什么反相色譜應(yīng)用如此廣泛?它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測(cè)定和分離。保留時(shí)間可以用分子的疏水性進(jìn)行描述和解釋。所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價(jià)格便宜、實(shí)用。選擇性可通過(guò)用緩沖溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)（通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度和膠團(tuán)粒子大小等等），以實(shí)現(xiàn)最佳分離。固定相-填充材料液相色譜柱填料盡管有有機(jī)高分子、石墨化碳、氧化鋁、氧化鈦，氧化鋯等，但多以全多孔硅膠作基質(zhì)。烷基鍵合固定相特性對(duì)保留值的影響：反相：鍵合相烷鏈長(zhǎng)，k大，選擇性好?，F(xiàn)代高效液相色譜柱的要求超純B型球形硅膠——峰形好、柱效高。不能有使色譜性能降低的直徑小于50?的微孔。粒徑尺寸從3μm到10μm——能滿足從分析到制備色譜規(guī)模的需求。色譜柱柱床裝填好——使用壽命長(zhǎng)、柱效高。封尾徹底——峰形好、使用壽命長(zhǎng)。批與批之間得重現(xiàn)性好。不同的相具有不同的選擇性——能更好的實(shí)現(xiàn)分離。鍵合相化學(xué)穩(wěn)定好——適用的pH范圍廣,使用壽命長(zhǎng)。HPLC色譜柱結(jié)構(gòu)類型內(nèi)徑D(cm)柱長(zhǎng)(cm)粒徑(μm)分析柱0.3–0.463-253-10微孔柱0.1,0.2115,253-8半制備柱0.8–1.010-255-20制備柱2.0–5.010-255-20HPLC在醫(yī)藥方面的應(yīng)用1、新藥研發(fā)：目標(biāo)物的檢測(cè)、純度等

2、藥品的預(yù)處理：片劑，油膏，水劑等

3、體液：血、尿、脊椎液、唾液等

4、抗菌素：青霉素、甾族(激素)等

5、其它……HPLC在環(huán)保方面的應(yīng)用1、農(nóng)藥殘留量分析：含氯農(nóng)藥、有機(jī)磷

農(nóng)藥、除蟲(chóng)菊等

2、致癌物質(zhì)：硝基呋喃及其代謝物、霉

素、亞硝胺、苯并芘等

3、水質(zhì)分析：內(nèi)分泌污染物等

4、其它……

HPLC在生化方面的應(yīng)用1、蛋白質(zhì)分析

2、肽類的分析

3、核酸

4、氨基酸

5、其它……

手性的普遍性及在醫(yī)藥中的重要性手性的發(fā)現(xiàn)和普遍存在Pasteur（1848年外消旋酒石酸鈉銨鹽晶體）實(shí)物與鏡像不重合蛋白質(zhì)、核酸等手性化合物的性質(zhì)

(旋光、手性環(huán)境)反應(yīng)停事件（20世紀(jì)六十年代）1956年，聯(lián)邦德國(guó)格侖南蘇藥廠開(kāi)始出售一種名為“反應(yīng)?！保ㄌ愤哙ね┑乃幬?，用于治療妊娠嘔吐反應(yīng)，并有鎮(zhèn)靜、安眠作用。（17個(gè)國(guó)家）