酶細(xì)胞原生質(zhì)體固定化

關(guān)于酶細(xì)胞原生質(zhì)體固定化12直接應(yīng)用酶的不足之處酶的穩(wěn)定性差一次性使用分離純化較困難第2頁,共109頁，星期六，2024年，5月3固定化酶的優(yōu)點(diǎn)酶的穩(wěn)定性明顯改善；酶的利用效率高；易于分離純化；反應(yīng)條件易于控制；適合于多酶催化反應(yīng)。第3頁,共109頁，星期六，2024年，5月4第一節(jié)酶固定化定義酶的固定化:是通過物理的或化學(xué)的手段，將酶束縛于水不溶的載體上，或?qū)⒚甘`在一定的空間內(nèi)，限制酶分子的自由流動(dòng)，但能使酶充分發(fā)揮催化作用。

固定化酶:固定在一定載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶;概念發(fā)展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一屆國際酶工程會(huì)議正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”第4頁,共109頁，星期六，2024年，5月5什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶（固定化酶）固定化技術(shù)第5頁,共109頁，星期六，2024年，5月6化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶第6頁,共109頁，星期六，2024年，5月7固定化酶制備原則（1）維持酶的催化活性及專一性；（2）有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化；（3）應(yīng)有最小的空間位阻；（4）酶與載體必須結(jié)合牢固；（5）應(yīng)有最大穩(wěn)定性，載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（6）成本要低。第7頁,共109頁，星期六，2024年，5月8酶的固定化方法（一）固定化方法分類非共價(jià)結(jié)合法結(jié)晶法分散法物理吸附法離子結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合法包埋法微囊法網(wǎng)格法一、酶固定化的方法第8頁,共109頁，星期六，2024年，5月9酶固定化方法示意圖第9頁,共109頁，星期六，2024年，5月101、吸附法(link)2、包埋法(link)3、結(jié)合法(link)4、交聯(lián)法(link)5、熱處理法(link)go一、酶固定化的方法第10頁,共109頁，星期六，2024年，5月111、吸附法通過氫鍵、疏水作用和π電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶載體上，從而制成固定化酶。固體吸附劑:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作簡(jiǎn)單，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用;(2)物理吸附結(jié)合能力弱，酶與載體結(jié)合不牢固易脫落.back第11頁,共109頁，星期六，2024年，5月12吸附法第12頁,共109頁，星期六，2024年，5月132、包埋法包埋法是將聚合物的單體與酶溶液混合，再借助于聚合助進(jìn)劑(包括交聯(lián)劑)的作用進(jìn)行聚合，酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化。多孔載體瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚酰胺、火棉膠等(1)凝膠包埋法(2)半透膜包埋法第13頁,共109頁，星期六，2024年，5月14第14頁,共109頁，星期六，2024年，5月152、包埋法(1)凝膠包埋法天然凝膠條件溫和，操作簡(jiǎn)便，對(duì)酶活影響小，強(qiáng)度較差合成凝膠強(qiáng)度高，耐溫度、pH值變化強(qiáng)，因需聚合反應(yīng)而使部分酶變性失活適用性：不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶類的固定化第15頁,共109頁，星期六，2024年，5月16如:天然高分子衍生物:

纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機(jī)械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機(jī)械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍第16頁,共109頁，星期六，2024年，5月17凝膠包埋條件酶活性強(qiáng)度天然凝膠瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、明膠溫和不變差合成凝膠聚丙烯酰胺、光交聯(lián)樹脂聚合反應(yīng)部分失活高使用的多孔載體及其特點(diǎn)第17頁,共109頁，星期六，2024年，5月18①聚丙烯酰胺凝膠包埋法。一般的制備過程如下：將1ml溶于適當(dāng)緩沖液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(單體)和40mgN，N’—甲叉雙丙烯酰胺(交聯(lián)劑)的3ml溶液中，再加0.5ml15％的二甲氨基丙腈(加速劑)，同時(shí)，加入1％過硫酸鉀(引發(fā)劑)，混合，于25℃：保溫10min，便得含酶凝膠。將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒．于低溫儲(chǔ)存或冷凍干燥。為制得珠狀固定化酶，可以在聚合反應(yīng)開始時(shí)，立即轉(zhuǎn)入到疏水相(一種乳化劑，與水相有相同密度)的有機(jī)溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠。(1)凝膠包埋法第18頁,共109頁，星期六，2024年，5月19聚丙烯酰胺包埋法的缺點(diǎn)是酶容易漏失，以低分子量蛋白質(zhì)為甚，如果調(diào)整交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)程度可以得到克服。聚丙烯酰胺凝膠包埋法：

APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第19頁,共109頁，星期六，2024年，5月20海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。顆粒大小可實(shí)時(shí)監(jiān)控第20頁,共109頁，星期六，2024年，5月21海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2

溶液中IE(orIC)第21頁,共109頁，星期六，2024年，5月22卡拉膠包埋法：卡拉膠(K-Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一種多糖，可以用來包埋酶。具體方法：將酶在37-50℃溶于水中，又將1.7g卡拉膠在40-60℃溶于生理鹽水中，二者混合后，趁熱滴在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成適當(dāng)大小的顆粒,即為固定化酶。第22頁,共109頁，星期六，2024年，5月23

卡拉膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)(1)凝膠包埋法第23頁,共109頁，星期六，2024年，5月24(2)半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔徑幾埃至幾十埃，比酶分子直徑小適用性底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的酶2、包埋法第24頁,共109頁，星期六，2024年，5月25微型膠囊法第25頁,共109頁，星期六，2024年，5月26微膠囊型固定化酶制備酶+親水性單體溶于水疏水性單體溶于有機(jī)溶液混合乳化劑乳化酶液分散成小水滴親水性、疏水性單體在兩相界面上聚合成半透膜，將酶包埋Tween-20破乳離心半透膜酶液滴第26頁,共109頁，星期六，2024年，5月273、結(jié)合法選擇適宜的載體,通過載體的共價(jià)鍵或離子鍵(非共價(jià)健)與酶結(jié)合在一起的固定化方法酶載體(1)離子鍵結(jié)合法載體:DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等不溶于水的離子交換劑操作:將酶液與載體混合攪拌幾個(gè)小時(shí);或?qū)⒚敢壕徛亓鬟^處理好的離子交換柱;活力損失少,結(jié)合力較弱，條件(pH值和離子強(qiáng)度)改變時(shí),酶易脫落第27頁,共109頁，星期六，2024年，5月28(1)離子鍵結(jié)合法第28頁,共109頁，星期六，2024年，5月29(2)共價(jià)鍵結(jié)合法載體分類:纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)等;也可分三類:天然有機(jī)載體(多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞）、無機(jī)物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍）方法載體活化:借助某種方法，在載體上引進(jìn)某一能夠與酶分子上某一基團(tuán)反應(yīng)的活潑基團(tuán)優(yōu)點(diǎn):結(jié)合很牢固，酶可連續(xù)使用較長時(shí)間缺點(diǎn):操作復(fù)雜，共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性3、結(jié)合法第29頁,共109頁，星期六，2024年，5月30載體活化方法1、重氮法;2、疊氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.第30頁,共109頁，星期六，2024年，5月31重氮法將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)生成重氮鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的重氮基團(tuán)第31頁,共109頁，星期六，2024年，5月32疊氮法含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成疊氮化合物第32頁,共109頁，星期六，2024年，5月33溴化氰法含有羥基的載體，如纖維素等，可用溴化氰活化生成亞氨基碳酸衍生物第33頁,共109頁，星期六，2024年，5月34烷基化法含羥基的載體可用三氯-均三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體back第34頁,共109頁，星期六，2024年，5月354、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的，所不同的是不使用載體雙功能試劑：戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等酶雙功能劑第35頁,共109頁，星期六，2024年，5月36雙功能試劑：

常用的是戊二醛

O

O H—C—CH2—CH2—

CH2—

C—H4、交聯(lián)法第36頁,共109頁，星期六，2024年，5月37

戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。

此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。第37頁,共109頁，星期六，2024年，5月38第38頁,共109頁，星期六，2024年，5月39戊二醛:優(yōu)點(diǎn)：結(jié)合牢固，可以長時(shí)間使用缺點(diǎn)：因交聯(lián)反應(yīng)激烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活損失大，顆粒較小，使用不便雙重固定化將其與吸附法、包埋法聯(lián)合使用第39頁,共109頁，星期六，2024年，5月40酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶back第40頁,共109頁，星期六，2024年，5月415、熱處理法在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體體內(nèi)適用性熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化嚴(yán)格控制加熱及其時(shí)間back第41頁,共109頁，星期六，2024年，5月42

酶的四種固定化方法第42頁,共109頁，星期六，2024年，5月43第43頁,共109頁，星期六，2024年，5月44第44頁,共109頁，星期六，2024年，5月45固定化方法吸附法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法物理吸附法離子吸附法制備難易易易較難難較難結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能費(fèi)用低低低高中等底物專一性不變不變不變可變可變各種固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較第45頁,共109頁，星期六，2024年，5月46固定化方法的比較吸附法：條件溫和、方法簡(jiǎn)便、載體可再生。但操作穩(wěn)定性差。共價(jià)法：操作穩(wěn)定性高。但由于試劑的毒性，易引起細(xì)胞的破壞。交聯(lián)法：可得到高細(xì)胞濃度，但機(jī)械強(qiáng)度低，無法再生，不適于實(shí)際應(yīng)用。包埋法：細(xì)胞和載體間沒有束縛，固定化后，細(xì)胞仍保持較高活力。但這類方法只適用于小分子底物。第46頁,共109頁，星期六，2024年，5月471、穩(wěn)定性(link)2、最適溫度(link)3、最適pH(link)4、底物特異性(link)

go二、固定化酶的特性第47頁,共109頁，星期六，2024年，5月481、穩(wěn)定性相對(duì)游離酶的優(yōu)點(diǎn)（1）對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度A固定化酶B游離酶第48頁,共109頁，星期六，2024年，5月49（2）保存穩(wěn)定性好，保存時(shí)間延長（3）對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解（4）對(duì)變性劑(如尿素、有機(jī)溶劑、鹽酸胍等)的耐受性提高，保留較高酶活（5）對(duì)酶抑制劑、對(duì)不同pH穩(wěn)定性提高.1、穩(wěn)定性第49頁,共109頁，星期六，2024年，5月50

可能的原因：①固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對(duì)酶的侵襲。1、穩(wěn)定性第50頁,共109頁，星期六，2024年，5月512、最適溫度與游離酶差不多A固定化酶B游離酶第51頁,共109頁，星期六，2024年，5月52例外用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游離酶高5-10℃;以共價(jià)結(jié)合法固定的色氨酸酶，比游離酶高5-15℃；湯亞杰以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃同一種酶2、最適溫度第52頁,共109頁，星期六，2024年，5月53不同方法和載體固定化氨基酰化酶的最適溫度(back)載體方法最適溫度(℃）游離60DEAE-葡聚糖凝膠離子鍵結(jié)合法72DEAE-纖維素離子鍵結(jié)合法67DEAE-葡聚糖凝膠烷基化法<60第53頁,共109頁，星期六，2024年，5月543、最適pH值酶固定化后，對(duì)底物作用的最適pH和酶—pH曲線常發(fā)生偏移，原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響pH對(duì)固定化前后天冬酰胺酶活力的影響第54頁,共109頁，星期六，2024年，5月55帶負(fù)電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的高(1)載體的帶電性質(zhì)對(duì)最適pH的影響原因:吸引作用帶正電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微環(huán)境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大環(huán)境偏堿酶不帶電荷的載體，固定化酶最適pH值一般不變第55頁,共109頁，星期六，2024年，5月56(2)產(chǎn)物酸堿性對(duì)最適pH值的影響酸性:固定化酶的最適pH值比游離酶的高堿性:固定化酶的最適pH值比游離酶的低中性:固定化酶的最適pH值一般不變?cè)?載體障礙產(chǎn)物的擴(kuò)散(back)第56頁,共109頁，星期六，2024年，5月574、底物的特異性與底物分子量的大小有關(guān);作用于低分子量底物的酶，沒有明顯變化，如氨基?；?、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往會(huì)發(fā)生變化。如，固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，而對(duì)酶蛋白的作用僅為游離酶的3%左右原因:載體的空間位阻作用(back)第57頁,共109頁，星期六，2024年，5月58影響固定化酶性能的因素固定化酶制備物性質(zhì)取決于所用的酶及載體材料的性質(zhì)(1)酶固定化后的變化主要是活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生變化(2)載體影響主要是在固定化酶的周圍形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層及靜電的相互作用等引起的變化第58頁,共109頁，星期六，2024年，5月59第59頁,共109頁，星期六，2024年，5月60第60頁,共109頁，星期六，2024年，5月61三、固定化酶的應(yīng)用1、工業(yè)生產(chǎn)(link)2、酶?jìng)鞲衅?link)3、藥物控釋載體（link)

go第61頁,共109頁，星期六，2024年，5月62現(xiàn)已用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶主要有：氨基?；钙咸烟钱悩?gòu)酶天門冬氨酸酶青霉素?；秆雍魉崦甫拢肴樘擒彰柑於彼屺Dβ―脫羧酶固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用第62頁,共109頁，星期六，2024年，5月631、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(1)氨基?；窤minoacylase首例，1969年，日本田邊制藥公司，DEAE-葡聚糖凝膠固定化酶,拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-aa，成本降低40%左右。乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala第63頁,共109頁，星期六，2024年，5月64泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第64頁,共109頁，星期六，2024年，5月65(2)葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大。熱處理法進(jìn)行固定化。1973年，已用于工業(yè)化生產(chǎn)。國內(nèi)外廣泛研究和應(yīng)用。1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用第65頁,共109頁，星期六，2024年，5月66(3)天冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝膠為載體固定化具高活力天冬氨酸酶的大腸桿菌，采用包埋法，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜膠固定化純酶，離子鍵結(jié)合法。1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用第66頁,共109頁，星期六，2024年，5月67(4)青霉素酰化酶1973年，催化青霉素或頭孢菌素水解6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA),也可催化6-APA或7-ACA與其他羧酸衍生物合成不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素;(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制造L-蘋果酸，聚丙烯酰胺包埋法，產(chǎn)氨短桿菌。1977年，由延胡索酸制L-蘋果酸，角叉菜膠包埋法，黃色短桿菌1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用第67頁,共109頁，星期六，2024年，5月68(6)?-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生產(chǎn)低乳糖奶(7)天門冬氨酸-?-脫羧酶1982年，天門冬氨酸生產(chǎn)L-丙氨酸。假單孢菌，凝膠包埋Back1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用第68頁,共109頁，星期六，2024年，5月692、固定化酶在酶?jìng)鞲衅鞣矫娴膽?yīng)用酶?jìng)鞲衅鳎汗潭ɑ?能量轉(zhuǎn)換器(電極、場(chǎng)效應(yīng)管、離子選擇場(chǎng)效應(yīng)管)，屬于生物傳感器的一種酶電極:固定化酶+電極，應(yīng)用最廣泛;用途:臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過程控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)go第69頁,共109頁，星期六，2024年，5月70生物傳感器用生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等）與物理、化學(xué)傳感器有機(jī)結(jié)合的一門交叉學(xué)科，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測(cè)方法與監(jiān)控手段，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法;在未來21世紀(jì)生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，生物傳感技術(shù)將是介于信息和生物技術(shù)之間的新增長點(diǎn);中國生物傳感器的研究起步于70年代末期。早期研究普遍采取氧電極作生物反應(yīng)中的換能器,以葡萄糖氧化酶為活性材料1、概述第70頁,共109頁，星期六，2024年，5月71生物傳感器(續(xù))傳感器能將一種被測(cè)信號(hào)（參量）轉(zhuǎn)換成一種可輸出信號(hào)的裝置。生物傳感器(biosensors):用生物成分作為感受器的傳感器。由感受器、換能器、電子線器組成2、生物傳感器組成和工作原理第71頁,共109頁，星期六，2024年，5月72感知固定化配基與待測(cè)物結(jié)合產(chǎn)生的微小變化，把這種變化轉(zhuǎn)化為其它可識(shí)別信號(hào)，其質(zhì)量好壞決定了傳感器的靈敏度。換能器是生物傳感器的心臟，整個(gè)生物傳感器的核心技術(shù)也在此。制備分兩方面工作，一是選擇最佳載體材料（需活化）；二是在載體表面固定化親和配基（非共價(jià)和共價(jià)）感受器第72頁,共109頁，星期六，2024年，5月73食品鮮度魚鮮度傳感器在日本、加拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測(cè)定。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。鮮度可用K值表示：K=肌苷+次黃嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+次黃嘌呤+尿酸第73頁,共109頁，星期六，2024年，5月74大多數(shù)魚死后5～20h，ATP，ADP和AMP已分解盡，超過24h，鮮度主要取決于IMP--肌苷---次黃嘌呤---尿酸。將這三個(gè)步驟的三種酶（5’－核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶）固定在氧電極上，制成魚鮮度測(cè)定儀。當(dāng)K＜20時(shí)，魚極新鮮，可供生食。

K在20～40之間為新鮮，必須熟食。

K大于40，不新鮮，不宜食用，這與嗅覺檢驗(yàn)結(jié)果相一致。第74頁,共109頁，星期六，2024年，5月75肉鮮度傳感器肉類在腐敗過程中會(huì)產(chǎn)生各種胺類，故胺類測(cè)定能反映肉類的新鮮程度。用腐胺氧化酶與過氧化氫電極構(gòu)成多胺生物傳感器，或用單胺氧化酶膜和氧電極組成的酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)定肉在貯藏過程中的鮮度。第75頁,共109頁，星期六，2024年，5月76污染微生物及病原菌的檢測(cè)1通過免疫學(xué)方法，即獲得相應(yīng)的特異性抗原和抗體進(jìn)行分析和檢測(cè)。第76頁,共109頁，星期六，2024年，5月77葡萄糖氧化酶電極1962年Clark和Lyons提出模型1967年Updike和Hicks首先制造聚丙烯酰胺凝膠包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜強(qiáng)度20-50μm基本結(jié)構(gòu)酶膜+多分子膜(聚四氟己烯等)+氧電極葡萄糖氧化酶電極第77頁,共109頁，星期六，2024年，5月78

半透膜 酶膠層

感應(yīng)電極

酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內(nèi)酯＋H2O第78頁,共109頁，星期六，2024年，5月79葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極第79頁,共109頁，星期六，2024年，5月GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode

根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測(cè)定葡萄糖的含量。第80頁,共109頁，星期六，2024年，5月81脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應(yīng)。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青霉素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3第81頁,共109頁，星期六，2024年，5月82青霉素酶電極酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝膠(或光交聯(lián)樹脂)電極:pH電極結(jié)合:酶膜緊貼在玻璃(pH)電極上反應(yīng):青霉素+H2O青霉烷酸+H+青霉素酶第82頁,共109頁，星期六，2024年，5月833、藥物控釋載體藥物應(yīng)用臨床不順利的原因:蛋白類藥物被胃酸破壞被肝和血液中的酶系統(tǒng)清除藥物本身毒副作用免疫問題藥物穩(wěn)定性差建立合理的給藥體系，核心是從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放第83頁,共109頁，星期六，2024年，5月843、藥物控釋載體控釋體系涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種聚合物載體上，也稱載體藥物(1)聚合物修飾(2)凝膠包埋(3)微球制劑(4)脂質(zhì)體(5)導(dǎo)向藥物Back第84頁,共109頁，星期六，2024年，5月854、固定化酶在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（1）消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應(yīng)，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時(shí)間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進(jìn)出。第85頁,共109頁，星期六，2024年，5月86（2）人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第86頁,共109頁，星期六，2024年，5月87第二節(jié)細(xì)胞固定化分類方式固定化細(xì)胞分類方式固定化細(xì)胞細(xì)胞類型微生物植物動(dòng)物生理狀態(tài)死細(xì)胞:完整細(xì)胞,細(xì)胞碎片,細(xì)胞器活細(xì)胞:增殖細(xì)胞,靜止細(xì)胞,饑餓細(xì)胞第87頁,共109頁，星期六，2024年，5月88⒈固定化細(xì)胞的定義

固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)能進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。

固定化活細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝。第二節(jié)細(xì)胞固定化第88頁,共109頁，星期六，2024年，5月89⒉固定化細(xì)胞的特點(diǎn)細(xì)胞特性+生物催化劑+固相催化劑①無須進(jìn)行酶的分離純化②保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高③比固定化酶穩(wěn)定性高④細(xì)胞內(nèi)酶附助因子可再生⑤細(xì)胞本身含多酶體系⑥抗污染能力強(qiáng)優(yōu)點(diǎn)第89頁,共109頁，星期六，2024年，5月90一、細(xì)胞固定化的方法吸附法包埋法第90頁,共109頁，星期六，2024年，5月911、吸附法

酵母細(xì)胞：pH3-5多孔陶瓷植物細(xì)胞：中空纖維動(dòng)物細(xì)胞：第91頁,共109頁，星期六，2024年，5月922、包埋法瓊脂凝膠包埋法海藻酸鈣凝膠包埋法角叉菜膠包埋法明膠包埋法聚丙烯酰胺凝膠包埋法光交聯(lián)樹脂包埋法第92頁,共109頁，星期六，2024年，5月93二、微生物細(xì)胞固定化細(xì)胞完整代謝調(diào)控發(fā)酵穩(wěn)定密度高質(zhì)粒穩(wěn)定（一）固定化微生物細(xì)胞的特點(diǎn)第93頁,共109頁，星期六，2024年，5月94二、微生物細(xì)胞固定化1.利用固定化微生物生產(chǎn)各種產(chǎn)物酒類、氨基酸、有機(jī)酸、酶和輔酶、抗生素、甾體轉(zhuǎn)化、廢水處理、維生素等。（二）固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用第94頁,共109頁，星期六，2024年，5月952.固定化微生物細(xì)胞制造微生物傳感器呼吸活性測(cè)定型電極活性測(cè)定型第95頁,共109頁，星期六，2024年，5月96三、植物細(xì)胞固定化提高存活率和穩(wěn)定性不容易聚集成團(tuán)更換培養(yǎng)液反復(fù)使用，連續(xù)使用易于料液分離（一）固定化植物細(xì)胞的特點(diǎn)第96頁,