T-SHAAV 014-2024 動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室技術(shù)要求

ICS11.220B42SHAAV團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SHAAV014—2024動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室技術(shù)要求LaboratorytechnicalrequirementsforgeneamplificationofanimalpathogeniCmicroorganisms2024-04-10發(fā)布2024-04-10實施上海市畜牧獸醫(yī)學(xué)會發(fā)布T/SHAAV0142024前言本文件按照GB/T1.12020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由上海市畜牧獸醫(yī)學(xué)會提出并歸口。本文件起草單位:上海市動物疫病預(yù)防控制中心、上海市奉賢區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖服務(wù)中心、上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、上海市松江區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集團(tuán))有限公司。本文件主要起草人:鞠厚斌、楊德全、王建、李鑫、趙洪進(jìn)、陳琦、盛文偉、吳文輝、陶軍、金一春、李布社、莊根平、楊顯超、王曉旭、葛菲菲、沈海瀟、周錦萍、李凱航、曹向英、石慧花、葛杰、李曉婕、唐燕婷。本文件首批承諾執(zhí)行單位名單:上海市動物疫病預(yù)防控制中心、上海市奉賢區(qū)生態(tài)養(yǎng)殖服務(wù)中心、上海市嘉定區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心、上海市松江區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心、上海祥欣畜禽有限公司、上海松林食品(集團(tuán))有限公司。T/SHAAV0142024動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室技術(shù)要求本文件規(guī)定了動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室總體要求、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制。本文件適用于動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室的布局設(shè)置及開展基因擴(kuò)增檢測活動。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/T27025檢測和校準(zhǔn)實驗室能力的通用要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評價方法CNAS-CLO1檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則CNAS-CL01-A024檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢測領(lǐng)域的應(yīng)用說明CNAS-GL029基因擴(kuò)增領(lǐng)域檢測實驗室認(rèn)可指南NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范JJF1527聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范JJF1815II級生物安全柜校準(zhǔn)規(guī)范JJG646移液器檢定規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。基因擴(kuò)增geneamplification通過生物體外試驗的方法為某一特定的基因的拷貝數(shù)選擇性地增加而其它基因并未按比例增加的過程(不包括自然基因擴(kuò)增),即以擴(kuò)增檢測DNA或RNA為方法的檢測技術(shù)。[來源:CNAS-CL01-A024,3]聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction,PCR體外擴(kuò)增DNA的酶促反應(yīng)過程。[來源:SNiT2102.12008,3.4.1]反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)reversetranscriptasepolymerasechainreaction,RT-PCR包括RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA和PCR擴(kuò)增兩步反應(yīng)。[來源:SNiT2102.12008,3.4.23.42T/SHAAV0142024實時熒光PCRreal-timePCR通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針,利用熒光信號累積實現(xiàn)對PCR擴(kuò)增效率、擴(kuò)增情況及數(shù)據(jù)進(jìn)行實時監(jiān)控的PCR方法。[來源:農(nóng)業(yè)部2259號公告4215,2.7]4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)EB:溴化乙錠(Ethidiumbromide)EDTA:乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)GITC:異硫氰酸胍(Guanidinethiocyanate)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)RNA:核糖核酸(Ribonucleicacid)5動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室的分區(qū)要求5.1.1設(shè)施和環(huán)境要求動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室設(shè)計和布局應(yīng)符合相關(guān)法律法規(guī)的要求,設(shè)施與環(huán)境應(yīng)符合GB19489、GB/T27025、CNAS-CLO1、CNAS-CL01-A024和CNAS-GL029中的規(guī)定。動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室,總體布局和各部位的安排應(yīng)減少潛在的對樣本的污染和對人員的危害,原則上應(yīng)設(shè)分隔開的工作區(qū)域,包括(但不限于):試劑配制與貯存區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。有條件的宜在所分隔的各工作區(qū)域設(shè)置緩沖間,緩沖間的壓力為負(fù)壓,與其相連的工作間為正壓,工作間與緩沖間之間宜安裝磁性連鎖裝置。未設(shè)置緩沖間的工作區(qū)域的壓力設(shè)計一般遵循試劑配制與貯存區(qū)為正壓,其它三個工作區(qū)域為負(fù)壓或減壓的原則。根據(jù)儀器設(shè)備的配置及功能,區(qū)域可適當(dāng)合并。如使用熒光定量PCR儀時,核酸擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可進(jìn)行合并;采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測為一體的自動化分析儀,則核酸提取區(qū)、核酸擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可進(jìn)行合并。不同功能的工作區(qū)域應(yīng)是分隔獨立的工作室,并有明顯的標(biāo)志,各區(qū)間不能直通,各區(qū)之間如果是緊密相連,需安裝物品傳遞艙。動物病原微生物基因擴(kuò)增實驗室的空氣流向可按照試劑配制與貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)進(jìn)行,防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前的區(qū)域?？砂凑諒脑噭┡渲婆c貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)方向空氣壓力遞減的方式進(jìn)行?？砂惭b排風(fēng)扇,負(fù)壓排風(fēng)扇裝置和其它可行的方式實現(xiàn)。5.2實驗室工作區(qū)域的設(shè)置及要求用于試劑的配制和貯存(包括商業(yè)化的試劑),所有試劑的配制與分裝。壓力可設(shè)置為正壓。5.2.2核酸提取區(qū)用于樣本的前處理,核酸的提取、純化與貯存,核酸提取質(zhì)量檢查等。樣本前處理所用器皿應(yīng)經(jīng)過徹底清洗和高壓消毒處理,并單獨使用。用過的器皿應(yīng)采取措施消除核酸的污染,否則不可重復(fù)使用。對于涉及臨床樣本的操作,應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護(hù)設(shè)備、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。應(yīng)防范病原微生物外泄和污染人員,保護(hù)樣本不被污染,應(yīng)配備II級生物安全柜。壓力可設(shè)置為常壓或負(fù)壓,可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。3T/SHAAV01420245.2.3核酸擴(kuò)增區(qū)用于擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和模板的加入,核酸擴(kuò)增。在巢式PCR測定中,第一輪擴(kuò)增后需打開反應(yīng)管,第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。壓力可設(shè)置為負(fù)壓,可按-20pa(緩沖間為常壓)設(shè)置,可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。5.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)用于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測和確認(rèn)。壓力可設(shè)置為負(fù)壓,可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。5.3工作基本原則5.3.1進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行,即試劑配制與貯存區(qū)核酸提取區(qū)→核酸擴(kuò)增區(qū)產(chǎn)物分析區(qū)。5.3.2各工作區(qū)域應(yīng)有明確的標(biāo)識,不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。5.3.3在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服,以便于鑒別。當(dāng)工作者離開工作區(qū)時,不得將各區(qū)特定的工作服帶出。5.3.4實驗室的清潔應(yīng)按試劑配制與貯存區(qū)至擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實驗區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具,不得混用,以防止交叉污染。5.3.5工作者在整個實驗操作過程中應(yīng)戴口罩和手套,并及時更換。5.3.6在操作過程中應(yīng)正確使用移液器,避免在移液操作中產(chǎn)生氣溶膠污染。5.3.7在樣本前處理、核酸提取等過程中出現(xiàn)實驗材料散落或PCR產(chǎn)物外濺時,應(yīng)立即進(jìn)行清潔處理并作出記錄。5.3.8實驗結(jié)束后,應(yīng)立即對工作區(qū)域進(jìn)行清潔。實驗臺面、超凈工作臺宜用3%雙氧水或10%次氯酸鈉溶液(含有效氯1gL)擦拭清潔;也可在擦拭后再用紫外線照射,照射距離應(yīng)不超過90cm,照射時間宜過夜。注:3%雙氧水和10%次氯酸鈉在使用前配制,配制好的溶液不宜長期存放。5.3.9實驗室及其設(shè)備的使用應(yīng)做好日常記錄。5.4安全防護(hù)工作者在整個實驗操作過程中應(yīng)戴手套、口罩、帽子,且應(yīng)根據(jù)病原微生物的類別,佩戴防護(hù)眼鏡、穿防護(hù)服或采取其他安全有效措施,應(yīng)按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5.5廢物處置5.5.1感染性材料所有感染性材料應(yīng)在實驗室內(nèi)通過高壓滅菌等方式清除污染再進(jìn)行處置,按照GB19489中的規(guī)定執(zhí)行。5.5.2移液器吸頭使用過的移液器吸頭應(yīng)放入含有10%次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡,浸泡時間不宜少于24h。5.5.3PCR產(chǎn)物和陽性質(zhì)粒含有PCR產(chǎn)物的所有液體及廢棄物和陽性質(zhì)粒應(yīng)放入含有1mol/L鹽酸(HCL)的容器中浸泡,浸泡時間不少于6h5.5.4瓊脂糖凝膠及電泳液對含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液的處理按照GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)行。6質(zhì)量保證6.1.1樣本的采集按NY/T541執(zhí)行。用于基因擴(kuò)增檢測的樣本包括內(nèi)臟組織,抗凝全血、血清,糞、尿及分泌物等。進(jìn)行靜脈采血時,宜使用專用的一次性安全真空采血器。進(jìn)行臟組織、糞、尿、分泌物4T/SHAAV0142024等的采樣時,應(yīng)注意防止交叉污染。6.1.2在某一疫病的病程中,樣本采集過早或過遲都會導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果,應(yīng)注意樣本采集時限性或時效性。6.1.3樣本的采集材料(如拭子)或試劑(如抗凝劑、防腐劑或其他常規(guī)添加劑)應(yīng)不干擾擴(kuò)增或檢測過程,抗凝劑應(yīng)選取EDTA或構(gòu)櫞酸鹽。6.1.4全血樣本應(yīng)進(jìn)行抗凝處理,采血后,應(yīng)在3h內(nèi)分離血漿。6.1.5無需抗凝處理的血液樣本,采血后,應(yīng)在1h內(nèi)分離血清,以避免RNA的降解。6.2樣本的穩(wěn)定化處理6.2.1用于DNA擴(kuò)增檢測的樣本,不需穩(wěn)定化處理,應(yīng)在采集后冷藏條件下及時送至實驗室。6.2.2用于RNA擴(kuò)增檢測的樣本,需穩(wěn)定化處理,應(yīng)在采集樣本時,將樣本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/LGrTC的試管中,從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。6.3樣本的運送樣本采集后應(yīng)盡快送至實驗室進(jìn)行檢測,運輸過程中,特別是在需要保持細(xì)胞的完整性時,應(yīng)注意避免樣本的過冷或過熱,并盡量減少細(xì)菌等污染物的生長,而且應(yīng)保證樣本中的靶核酸免受內(nèi)源性或外源性核酸酶的破壞與降解。6.4樣本的貯存6.4.1采集的臨床樣本可于-70℃以下長時間貯存。6.4.2用于PCR測定的DNA靶核酸樣本應(yīng)在10mmol/LTris-1mmolLEDTA緩沖液(PH7.5~8.0)中4℃保存。6.4.3用于PCR測定的RNA靶核酸樣本應(yīng)在一定緩沖液中-80℃或液氮中貯存。6.4.4用乙醇或異丙醇等沉淀的靶核酸樣本貯存在-20℃即可。6.4.5用GITC處理的RNA樣本可在室溫保存7d。6.5樣本的處理6.5.1樣本的處理應(yīng)盡量簡化,以減少樣本的交叉污染或丟失靶核酸的機(jī)會。6.5.2待擴(kuò)增的靶核酸可能來源于不同的臨床樣品,如血液、體液、糞便、組織等。靶核酸可有不同的存在形式和存在部位。應(yīng)根據(jù)靶核酸不同的存在狀態(tài),采取相應(yīng)的處理方法,選取相應(yīng)的商品化核酸提取試劑盒。6.5.3核酸樣本的濃度、純度和完整性的質(zhì)量評價方法見GBT40974。6.6逆轉(zhuǎn)錄CDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個酶反應(yīng)步驟,應(yīng)避免逆轉(zhuǎn)錄效率的降低或完全缺乏;樣本中避免存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)及RNA酶的存在。6.7核酸擴(kuò)增多種因素可引起核酸擴(kuò)增檢測的假陽性或假陰性結(jié)果,如擴(kuò)增靶核酸中抑制劑存在、Taq酶失活、退火溫度不當(dāng)、Mg2+濃度不佳、樣本或試劑受污染等。6.8擴(kuò)增產(chǎn)物的分析6.8.1擴(kuò)增產(chǎn)物的分析方法有多種,如瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、限制性酶切、斑點印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等。擴(kuò)增產(chǎn)物是主要的污染來源,應(yīng)避免通過物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。6.8.2使用過的移液器吸頭、PCR產(chǎn)物和含有EB或經(jīng)EB浸泡過的瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液分別按本文件中5.5.2、5.5.3和5.5.4中規(guī)定處理。6.8.3在用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如EB、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,應(yīng)注意工作人員的安全防護(hù)。5T/SHAAV01420246.9污染的分析與處理檢測過程中對污染的預(yù)防和處理原則,防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的規(guī)定執(zhí)