T-STIC 130021-2024 乳及乳制品中2-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS67.050CCSX00STICDeterminationof2'-FucosyllactoseandLacto-N-neotetraoseinMilkandDairyproductsbyLiquidChromatography-Mass/MassSpectrometryIT/STIC130021—2024 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 4原理 5試劑和材料 6儀器和設(shè)備 7測(cè)定步驟 8分析結(jié)果的表述 9精密度 10檢出限與定量限 附錄A多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）條件 5附錄B2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖示例 6T/STIC130021—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由上海市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件由上海市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證協(xié)會(huì)發(fā)布。本文件起草單位：上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院、內(nèi)蒙古智慧質(zhì)量中心有限公司、蒙牛乳業(yè)（沈陽(yáng)）有限責(zé)任公司、內(nèi)蒙古歐世蒙牛乳制品有限責(zé)任公司、雅士利國(guó)際集團(tuán)有限公司、青島海關(guān)技術(shù)中本文件主要起草人：李冰、趙玉然、劉天益、張慧萍、黃文強(qiáng)、錢(qián)文濤、李秋琴、呂寧、唐亞娟、李慧娟、王艷華、潘思奕、劉明、白國(guó)平。1T/STIC130021—2024乳及乳制品中2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖含量的測(cè)定液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了乳及乳制品中2′-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于液體調(diào)制乳、發(fā)酵乳以及以牛乳和羊乳為原料的嬰幼兒調(diào)制乳粉中2′-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理樣品經(jīng)乙醇溶液沉淀提取，低溫高速離心，除去脂肪蛋白，樣品中的低聚糖經(jīng)硼氫化鈉還原成結(jié)構(gòu)相同的開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法定量。5試劑和材料除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。5.1試劑5.1.1乙腈（C2H3N），色譜純。5.1.275%乙醇（C2H6O）。5.1.3甲酸銨（NH4HCO2優(yōu)級(jí)純及以上。5.1.4硼氫化鈉溶液（10g/L）：優(yōu)級(jí)純硼氫化鈉（NaBH4），稱(chēng)取1.0g硼氫化鈉，加入80mL水，溶解后，用水定容至100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。5.1.5乙酸溶液（15mL/L）：優(yōu)級(jí)純乙酸，吸取1.5mL乙酸，用水稀釋至100mL。5.1.6甲酸銨溶液（10mmoL/L）：稱(chēng)取0.318g甲酸銨，用水溶解并定容到500mL中，混勻。5.1.72'-巖藻糖基乳糖（C18H32O15CAS號(hào)41263-94-9，純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.1.82'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10mg/mL準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg2'-巖藻糖基乳糖（按照實(shí)際純度折算質(zhì)量），用水溶解稀釋并定容10mL。分裝后置于-18℃條件可儲(chǔ)存6個(gè)月。5.1.9乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)品（C26H45NO21CAS號(hào)13007-32-4，純度≥95%，或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2T/STIC130021—20245.1.10乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（10mg/mL準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg乳糖-N-新四糖（按照實(shí)際純度折算質(zhì)量），用水溶解稀釋并定容10mL。分裝后置于-18℃條件可儲(chǔ)存6個(gè)月。5.1.112'-巖藻糖基乳糖和乳糖-N-新四糖混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取1mL2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和0.5mL乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10mL容量瓶中，并用水定容至刻度配制成2'-巖藻糖基乳糖濃度為1mg/mL、乳糖-N-新四糖濃度為0.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中間液，置于-18℃條件可儲(chǔ)存6個(gè)月。5.1.12混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：可采用同類(lèi)樣品類(lèi)型的空白基質(zhì)溶液或水配制，2'-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)工作液參考濃度1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL，乳糖-N-新四糖標(biāo)準(zhǔn)工作液參考濃度0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL。5.2材料5.2.1離心管：2mL，15mL。5.2.210mL比色管。5.2.310mL容量瓶。5.2.4微孔濾頭：有機(jī)相，0.22μm。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）。6.2色譜柱，ACQUITYBEHAmideColumn(150×2.1mm,1.7μm,Waters)或性能相當(dāng)著。6.3移液器，量程10μL-100μL和100μL-1000μL。6.4分析天平，感量0.0001g和0.001g。6.5高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于12000r/min。6.6渦旋混合器。7測(cè)定步驟7.1提取7.1.1固體試樣：準(zhǔn)確稱(chēng)取20.0g（m1，精確至0.001g）固體乳粉試樣,加水至100g（m2，精確至0.001g徹底溶解混勻，取5.0g（m3，精確至0.001g）至可準(zhǔn)確定容的10mL比色管或容量瓶中，用75%乙醇定容至10mL，渦旋混勻，取1mL樣品溶液至2mL離心管，進(jìn)行低溫離心處理。將2mL離心管中樣品-20℃冷凍1h，4℃12000r/min離心15min沉淀蛋白及除脂肪，準(zhǔn)確吸取離心管中的上層清液100μL（低濃度樣品如小于30mg/100g時(shí)，可加大吸取體積）至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混勻，取1.5mL樣品12000r/min離心5min，得樣品清液備用。7.1.2液體試樣：用可準(zhǔn)確定容的10mL比色管或容量瓶稱(chēng)取均勻液體試樣1.0g（m3，精確至0.001g加入水4mL混勻，用75%乙醇定容至10mL，渦旋混勻，取1mL樣品溶液至2mL離心管，進(jìn)行低溫離心處理。將2mL離心管中樣品-20℃冷凍1h，4℃12000r/min離心15min沉淀蛋白及除脂肪，準(zhǔn)確吸取離心管中的上層清液200μL（低濃度樣品如小于30mg/100g時(shí)，可加大吸取體積）至10mL比色管或容量瓶中，用30%乙腈溶液定容至10mL，混勻，取1.5mL樣品12000r/min離心5min，得樣品清液備用。7.2還原3T/STIC130021—2024取0.8mL樣品清液轉(zhuǎn)移至15mL離心管內(nèi)，加入500μL硼氫化鈉溶液，旋渦振蕩混勻，室溫反應(yīng)30min，期間每隔5min旋渦振蕩一次。緩慢加入500μL乙酸溶液，室溫下放置30min，每隔5min旋渦振蕩一次，不再產(chǎn)生氣泡為止?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液也同步取0.8mL，與樣品同步進(jìn)行還原，且最終定容體積相同。最終處理液經(jīng)0.22μm微孔濾頭過(guò)濾至進(jìn)樣小瓶，待測(cè)試上機(jī)。7.3工作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備空白基質(zhì)溶液：取同類(lèi)型不含2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的樣品做空白基質(zhì)，前處理過(guò)程同樣品，得空白基質(zhì)，用于標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液曲線(xiàn)：準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)溶液制備不同濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)工作液，混勻后同樣品同步還原、上機(jī)測(cè)定后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。7.4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀參考條件7.4.1液相色譜參考條件7.4.1.1色譜柱：ACQUITYBEHAmideColumn(150×2.1mm,1.7μm,Waters)或性能相當(dāng)著。7.4.1.2流動(dòng)相：流動(dòng)相A為10mmol/L甲酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈；7.4.1.3流速0.3mL/min。7.4.1.4進(jìn)樣體積：5μL。7.4.1.5柱溫：40℃。7.4.1.6梯度洗脫參考程序：見(jiàn)表1。表1酰胺色譜柱梯度洗脫程序時(shí)間(min)流動(dòng)相A(%)流動(dòng)相B(%)09036.560409909.5907.4.2質(zhì)譜參考條件7.4.2.1離子源：ESI源。7.4.2.2離子源參數(shù)：離子傳輸管溫度250℃。7.4.2.3噴霧電壓：4.5kV。7.4.2.4監(jiān)測(cè)模式：負(fù)離子監(jiān)測(cè)模式。7.4.2.5掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。7.4.2.6實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)狻?.4.2.7多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的母離子、子離子、碰撞電壓、錐孔電壓參見(jiàn)附錄A。7.5液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定根據(jù)樣液中待測(cè)組分的含量，選定濃度相近的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液或者依據(jù)曲線(xiàn)調(diào)整樣品稀釋倍數(shù)，將制備好的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣液等體積注入LC-MS/MS中測(cè)定。4T/STIC130021—20247.5.1定性測(cè)定按照上述條件測(cè)定試樣及標(biāo)準(zhǔn)工作液，試樣中待測(cè)組分的保留時(shí)間與基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液中對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間偏差在±2.5%之內(nèi)；且樣品譜圖中各組分定性離子的相對(duì)豐度與濃度相近的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液譜圖中對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差不超過(guò)表2規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對(duì)應(yīng)的待測(cè)物。表2多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）監(jiān)測(cè)時(shí)定量定性離子對(duì)相對(duì)豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度%>5020～5010～20≤10允許的相對(duì)偏差%±20±25±30±507.5.2定量測(cè)定7.5.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度為橫坐標(biāo)，以試樣前后兩次進(jìn)樣的標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液平均響應(yīng)值（峰面積）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。7.5.2.2試樣溶液的測(cè)定：將試樣溶液按儀器參考條件進(jìn)行測(cè)定，得到樣品溶液中對(duì)應(yīng)組分的色譜峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到待測(cè)組分的濃度。2'-巖藻糖基乳糖及乳糖-N-新四糖多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖參見(jiàn)附錄B。8分析結(jié)果的表述試樣中2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的含量按公式（1）計(jì)算：式中：X—試樣中待測(cè)組分含量，單位為毫克每百克(mg/100g)；c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到的待測(cè)試樣溶液中待測(cè)組分的濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV—定容體積，單位為毫升（mL）；f—稀釋因子，液體試樣f為50，固體試樣10-1—單位換算系數(shù)；m3—取樣質(zhì)量，單位為克（g）。計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的10%。10檢出限與定量限本方法對(duì)2'-巖藻糖基乳糖、乳糖-N-新四糖的檢出限為3mg/100g，定