蛋白質(zhì)組學(xué)及其主要研究方法

蛋白質(zhì)組學(xué)及其主要研究方法摘要:蛋白質(zhì)組學(xué)是對機(jī)體、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能模式進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)組是動態(tài)的，隨內(nèi)外界刺激而變化，對蛋白質(zhì)組的研究可以使我們更容易接近對生命過程的認(rèn)識。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)研究所使用的主要技術(shù)如二維凝膠電泳、質(zhì)譜、酵母雙雜交系統(tǒng)、生物信息學(xué)等進(jìn)行了相關(guān)綜述。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向凝膠電泳；質(zhì)譜；酵母雙雜交；生物信息學(xué)ProteomicsanditsmainresearchtechniquesAbstract:Proteomicsaimsattheanalysisandidentificationofentireproteinspresentinthecelltissueortheorganism,andofthefunctionsandthelinkageoftheseproteins.theproteomeofanorganismisdynamic.Itchangeswiththeintroandouterstimulus.Thestudyonproteomicscanmakeuseasilyknowhowthevitalprogressgoes.Thearticlewillintroducethesetech-niquesofproteomicssuchastwo-dimensionalgelelectrophoresis、massspectrometry、two-hybridsystemandbioinformaticsetc.Keywords:Proteomics;Two-dimensionalgelelectrophoresis;Massspectrometry;Two-hybridsystem;Bioinformatics眾所周知,始于20世紀(jì)90年代初的龐大的人類基因組計劃業(yè)已取得了巨大的成就，人類基因組序列草圖已經(jīng)繪制完成[1]。但是,由于基因的主要功能是通過其表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的,因此要揭示整個生命活動的規(guī)律,就必須對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)在合成之后具有相對獨(dú)立的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)和相互間作用能力,同時還具有對外界因素發(fā)生反應(yīng)的能力。因此,只有從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對生物體整體水平上的蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，才能更好地幫助人們了解生命的本質(zhì)，各器官的分子結(jié)構(gòu)、功能及其行使該功能的機(jī)制等。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展是伴隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù),尤其是雙向凝膠電泳和新型質(zhì)譜技術(shù)以及生物信息學(xué)的發(fā)展而發(fā)展的，本文將對蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究技術(shù)作一概述。蛋白質(zhì)組學(xué)產(chǎn)生背景、概念及內(nèi)容1.1蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起在后基因組時代，研究的重點(diǎn)已從揭示遺傳信息轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上來。但是，由于生物功能主要體現(xiàn)者是蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)有其自身特有的活動規(guī)律。如蛋白質(zhì)修飾加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、結(jié)構(gòu)變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用等，均無法在基因組水平上獲得。因為基因組學(xué)有這樣的局限性，促使人們從整體水平上探討細(xì)胞蛋白質(zhì)的組成及其活動規(guī)律[2]。1.2蛋白質(zhì)組學(xué)概念的提出蛋白質(zhì)組被定義為細(xì)胞,器官或組織型的蛋白質(zhì)成分的總稱[3]；而蛋白質(zhì)組學(xué)是研究這些成分在指定的時間或特定的環(huán)境條件下的表達(dá)，具體說它是對不同時間和空間上發(fā)揮功能性特定蛋白質(zhì)群組進(jìn)行研究，即在蛋白質(zhì)水平上探索其作用模式、功能機(jī)理、調(diào)節(jié)調(diào)控，以及蛋白質(zhì)群組內(nèi)相互作用。其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動規(guī)律。因為蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者,是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者,對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明生命在生理或病理條件下的變化機(jī)制。1.3蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)從其研究內(nèi)容方面可分為表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)[4]。表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究細(xì)胞或組織在不同條件如藥物或疾病狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)和功能，這將有助于識別疾病特異蛋白、藥物作用靶點(diǎn)、藥物功效和毒性標(biāo)記等；結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)是識別蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并研究蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)之間的相互作用與控制細(xì)胞生長、復(fù)制等的代謝和信號通路有關(guān)，蛋白質(zhì)之間相互作用的改變可能引起人類疾??；功能蛋白質(zhì)組學(xué)是位于對個別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對象的蛋白質(zhì)組研究之間的層次。從理論的角度講,因此,對“全部蛋白質(zhì)”的研究是非常困難的,而功能蛋白質(zhì)組學(xué)則注重于從局部入手,把目標(biāo)定位在蛋白質(zhì)群體上。這樣的群體可大可小,取決于要研究的功能特點(diǎn)和所用的研究手段。功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究可只注重那些可能涉及到特定功能機(jī)理的蛋白質(zhì)群體。2.蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)典型的蛋白質(zhì)組學(xué)分析是在蛋白提取后，先凝膠的或非凝膠的方法分離蛋白質(zhì),然后以不同的質(zhì)譜分析方法進(jìn)行蛋白分析、鑒定，接著以生物信息學(xué)輔助獲取和深入分析全面的信息，并可以指導(dǎo)更深層的功能蛋白質(zhì)學(xué)研究[5]。2.1蛋白樣品的制備通常可采用細(xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。樣品預(yù)分級的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級，如專門分離出細(xì)胞核、線粒體或高爾基體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測,還可以針對某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。2.2色譜技術(shù)色譜技術(shù)的原理是溶于流動相中的各組分經(jīng)過固定相時,與固定相發(fā)生相互作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等),由于作用的大小、強(qiáng)弱等不同,各組分在固定相中滯留的時間不同,由此從固定相中流出的先后也不同,最終使不同組成成分得到分離。色譜法根據(jù)分離原理分類,有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、排阻色譜、凝膠滲透色譜及親和色譜等。按操作形式可分為紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法等[6]。根據(jù)流動相的物理狀態(tài)不同可分為:氣相色譜法和液相色譜法。高效液相色譜法(HPLC)是以液體作為流動相,并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。它是在傳統(tǒng)液相色譜的基礎(chǔ)上,輔以高效固定相、高壓泵和高靈敏度檢測器及計算機(jī)技術(shù)的應(yīng)用,從而實現(xiàn)了液相色譜分析的高效、高速、高靈敏和自動化操作,因此被稱為HPLC。它對樣品的適用性廣,不受分析對象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制,適于分離分析沸點(diǎn)高、熱穩(wěn)定性差、分子量大的許多有機(jī)物和一些無機(jī)物,但是HPLC的固定相的分離效率、檢測器的檢測范圍以及靈敏度等。2.3雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳(Two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)仍是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)。其基本原理:第一項基于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦;第二項則根據(jù)分子量的不同大小進(jìn)行SDS分離，把復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的蛋白質(zhì)在二維平面上分開。根據(jù)第一項等電聚焦條件和方式的不同,可將雙相電泳分為三種系統(tǒng)[7]。第一種是在聚丙烯酰胺管中進(jìn)行,載體兩性電解質(zhì)在外加電場作用下形成pH梯度，它的最大缺點(diǎn)是不穩(wěn)定,易發(fā)生陰極漂移，重復(fù)性差。第二種系統(tǒng)主要是采用丙烯酰胺和不同的pH值的固定化電解質(zhì)共聚所形成的具有pH梯度的膠，此種膠條的形成需要一些能與丙烯酰胺單體結(jié)合的分子，每個含有一種酸性或堿性緩沖基團(tuán)。第三種系統(tǒng)是非平衡pH梯度電泳,常常被用來分離堿性蛋白質(zhì)。由于雙向電泳利用了蛋白質(zhì)兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)分離,其分辨率非常高。蛋白質(zhì)被分離以后用考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染色或放射性標(biāo)記等方法顯示。其中銀染比考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度高，蛋白質(zhì)分辨率可以達(dá)ng級[8]。但是銀染的線性效果并不是很好，并且對質(zhì)譜分析干擾大；考馬斯亮藍(lán)染色線性、均一性較高，對質(zhì)譜干擾較小，但蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)是預(yù)測時最復(fù)雜和最困難的預(yù)測技術(shù)。序列差異較大的蛋白質(zhì)序列也可能折疊成類似的三維構(gòu)象。由于蛋白質(zhì)的折疊過程并不十分清晰,從理論上解決蛋白質(zhì)折疊的問題還有待進(jìn)一步的科學(xué)發(fā)展,但也有了一些有一定作用的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測方法。即與已知結(jié)構(gòu)的序列比較,同源模建,threading算法和折疊識別方法[17]。2.6.2生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)功能生物信息學(xué)發(fā)展到今天,不僅可以對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和預(yù)測,而且可以對已知或者未知的基因產(chǎn)物進(jìn)行功能上全面的分析和預(yù)測。生物信息學(xué)最常用的分析方法是模式識別。主要是利用存在于蛋白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)中的某些特殊的特征模體來識別相關(guān)蛋白質(zhì)性質(zhì)。換而言之,就是從新的蛋白序列中發(fā)現(xiàn)標(biāo)志性的序列或者結(jié)構(gòu),以此建立模式,然后在已經(jīng)建立好的已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中,搜集與此相似的模式,來確定未知蛋白質(zhì)的歸屬,從而預(yù)測它的功能[18]。許多基因是在特定時期和條件下被激活,才能表達(dá)出來,在正常人工模擬的環(huán)境下根本無法表達(dá)。類似于這樣的未知蛋白質(zhì)也需要通過生物信息學(xué)的方法計算分析預(yù)測,以獲得它的功能信息。3.結(jié)束語蛋白質(zhì)組學(xué)為直接在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模研究基因功能提供了有力工具。利用質(zhì)譜技術(shù)研究凝膠分離的蛋白質(zhì)對蛋白質(zhì)功能研究具有重要作用。蛋白質(zhì)鑒定將在高通量、高靈敏度、完整性等方面進(jìn)一步完善[19]；分析手段將向自動化、微量化、平行化方向發(fā)展。21世紀(jì)將是一個整體細(xì)胞生物學(xué)的時代，DNA和RNA的信息加上相應(yīng)的蛋白質(zhì)信息的補(bǔ)充和提高，將構(gòu)成完整的細(xì)胞分子生物學(xué)的研究[20]。參考文獻(xiàn)：[1]WilkinaMR,PpasqualiC,AppelRS,etal.Fomproteinstoproteomes:large-scaleproteinidentificationbytwo-dimensionalelectrophoresisandaminoacidanalysis[J].Biotechology,1996,14(1):61-65[2]歐陽學(xué)劍.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育,2008,6(11）:1439-1440[3]馮昌銀,鄭智勇,余英豪.蛋白組學(xué)技術(shù)及其在器官移植中的應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)綜述,2008,14(8):1147-1150[4]李煌,李松,徐蕓,等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號傳遞機(jī)制研究中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)（口腔醫(yī)學(xué)分冊）,2005,32(5):344-346[5]鄒清華,張建中.蛋白質(zhì)組學(xué)的相關(guān)技術(shù)及應(yīng)用[J].生物技術(shù)通訊,2003,14(3):210-213.[6]張宏一.蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)及其進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報,2005,6(4):31-34.[7]CordwellSJ,BassealDJ,BjellqvistB,etal.Electrophoresis,1997,18(8):1393~1398.[8]衛(wèi)功宏,印莉萍.蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)概念與技術(shù)及其研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志,2002,19(4):20-22.[9]李明,周宗燦.蛋白質(zhì)芯片[J].生命的化學(xué),2001,21(2):156-157·[10]李佰良.功能蛋白質(zhì)組學(xué)[J].生命的化學(xué).1998,18(6);1-3.[11]StephenK,Burley.Anoverviewofstructuralgenomics[J].NatureStructrueBiolNovember2000,supplement,7:932-934·[12]EmmettMR,CaprioliRM.Micro-electrospraymassspectrometry:ultra-high-sensitivityanalysisofpeptidesandproteins[J].J.Am.Soc.MassSpectrom,1994[13]趙宏偉,田秀珠,王波.差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)與哲學(xué):臨床決策論壇版,2006,27(4):45-47.[14]明亮,劉杰.蛋白質(zhì)組學(xué)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].南通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2006,26(2):151-153.[15]成海平,錢小紅.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系及其進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27(6):584-588.[16]McDonaldWH,YatesJR3rd.Shotgunproteomics:integratingtechnologiestoanswerbiologicalquestions[J].Curr.Opin.Mol.Ther,2003,5:302–309.[17]TanakaK.Theoriginofmacromoleculeionizationbylaserirradiation(Nobellecture)[J].Angew.Chem.Int.Ed.Engl,2003,42:3860–3870.[18]DianeG.Massspect