淺談對實時熒光定量PCR技術的理解

淺談對實時熒光定量PCR技術的理解實時熒光定量PCR(RealtimefluorescencequantitativePCR，RT-qPCR)是一種實時監(jiān)控DNA擴增反應的技術。在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累進行實時監(jiān)測整個PCR過程，并將DNA的累積速率繪制成動態(tài)變化圖，在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量，從而消除了在測定終端產(chǎn)物豐度時有較大變異系數(shù)的問題。該項技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，促使PCR技術從定性到定量的飛躍，而且集特異性強、自動化程度高、靈敏度好、污染少等優(yōu)點為一體，現(xiàn)已在生物研究、醫(yī)藥、食品等領域得到廣泛應用。RT-qPCR的基本原理和應用基本原理RT-qPCR的分類方法根據(jù)其化學原理可分為探針類和非探針類兩種,下面以TaqMan探針類和SYBRGreenⅠ非探針類兩種常見方法簡述其原理。TaqMan探針法TaqMan探針是一種長度為20-24bp寡核苷酸探針，在其5′末端標記一個熒光報告基團(reporter,R)，在3′末端則標記一個熒光淬滅基團。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入TaqMan熒光探針,其結合位點在兩條引物之間,只與模板特異地結合。當完整的探針與目標序列雜交時,熒光基團發(fā)射的熒光信號與3′端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時,聚合酶的5′外切酶活性將探針進行酶切,將DNA探針逐個降解，使得熒光基團與淬滅劑分離。這樣PCR體系中熒光的強度與PCR產(chǎn)物量之間呈正比,可通過測定熒光強度而對PCR產(chǎn)物定量。如下圖1-1至圖1-11所示為TaqMan探針工作原理簡圖：

熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET能量激發(fā)光淬滅基團激發(fā)光圖STYLEREF1\s圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s11切斷的探針，檢測到報告熒光圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s12完整的探針，檢測不到報告熒光圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s13變性圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s14退火圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s15延伸（1）具有5′-3′外切酶活性5′-3′外切酶活性5′-3′外切酶活性圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s16延伸（2）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s17延伸（3）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s18延伸（4）圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s19延伸（5）報告基團和淬滅基團分離而發(fā)光報告基團和淬滅基團分離而發(fā)光圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s110延伸（6）圖圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s111延伸（7）SYBRGreenⅠ染料法SYBRGreenⅠ熒光染料是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于DNA雙鏈的小溝區(qū)域，其最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號。因此，根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系中存在的雙鏈DNA數(shù)量。如圖1-12和圖1-13為SYBRGreenⅠ工作原理簡圖:圖STYLEREF1\s圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s112SYBR染料處于游離狀態(tài)圖STYLEREF1\s1SEQ圖\*ARABIC\s113SYBR染料與雙鏈DNA分子結合兩種方法的優(yōu)缺點總而言之，探針類是利用與靶序列特異性結合的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加，非探針類則是利用熒光染料或特殊設計的引物來指示擴增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但價格昂貴。后者可以與所有的雙鏈DNA相結合,因此設計的程序通用性好,且價格相對較低，更簡便易行。特別地，由于SYBRGreenI與所有的雙鏈DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性?？梢酝ㄟ^測量升高溫度后熒光的變化幫助降低非特異產(chǎn)物的影響，由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量結果。RT-qPCR技術的主要應用醫(yī)學領域RT－qPCR技術目前應用最為廣泛的是醫(yī)學領域，包括病原體的檢測，例如病毒、細菌、病原體的定量監(jiān)測及治療藥效評價；基因的點突變及單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析；臨床疾病的診斷，如各型肝炎、艾滋病、禽流感、結核、性病診斷，腫瘤基因的檢測和診斷等。植物中的應用RT－qPCR技術是一種很好的檢測基因表達的方法，通過RT－qPCR可以分析植物在不同處理條件下基因樣本的表達差異，也可以分析植物在不同生長發(fā)育時期基因表達的差異。該項技術的應用對植物病理學研究和植物遺傳育種研究起到了推進作用。食品安全應用RT－qPCR技術對食品中的微生物進行檢測和研究，不僅可以對活體微生物核酸量進行檢測，還可以對已死的生物進行檢測。該項技術的應用也使得轉(zhuǎn)基因食品的檢測突破了從定性到定量的界限。其他科學研究此外，RT－qPCR技術在其他分子生物學相關定量研究領域的應用也取得了較大進展，如：在動植物基因工程、微生物鑒定與分類、昆蟲分類和鑒定中的應用及昆蟲檢疫等。一般實驗步驟在進行實時熒光定量PCR前，主要有RNA樣品抽提、RNA質(zhì)量檢測、樣品cDNA的合成，引物設計合成及其他藥品購買，選擇合適的熒光定量方法等。在正式試驗前需進行驗證實驗，以確定擴增效率（一般大于1.9為有效）、動力學范圍，確保準確度、精密度。接著需要做的有：梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR、制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板、待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR、電泳檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶及數(shù)據(jù)分析。特別地，學院現(xiàn)有的7500型實時熒光定量PCR儀可同時實現(xiàn)特異性靶基因檢測與定量。7500型實時熒光定量PCR儀采用96孔反應板或單個及8聯(lián)管，反應體積25-100ul。該儀器將PCR熱循環(huán)，熒光檢測和各種應用分析軟件結合在一起，可以動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)各反應管中PCR擴增產(chǎn)物逐漸增加的情況。PCR實驗結束后可以馬上得到定量結果，無需凝膠電泳分析和PCR產(chǎn)物純化。常見問題分析如何甄別可疑的擴增根據(jù)電腦自動給出的標準曲線，確定樣品所含的目的DNA初始量時，標準曲線的相關性應該不小于95%。同一樣品的3個平行反應所得出的Ct值之間的差值不應大于0.5。甄別可疑擴增還可以通過這三方面來判別，看擴增曲線的形狀，正確的擴增一般有明顯擴增階段（特別是指數(shù)增長期），所有的曲線有較好平行性。查看Y軸的數(shù)值，“可疑”曲線的指數(shù)增長期范圍常常是落在1e-2的范圍內(nèi)?？淳€性圖，曲線沒有明顯的上升趨勢則提示不存在正確擴增。試驗重復的問題一般來說，為了減少加樣以及實驗系統(tǒng)的誤差，每一次實驗內(nèi)包含兩個生物學重復，即處理同樣的東西兩份，也有兩個相應的對照。所以一般直接取平均值，若出現(xiàn)一個數(shù)值偏差，則去除離群值，取剩下的兩個值平均。若三個值分散都太大，則說明實驗操作可能存在問題，需要重新實驗。實驗重復率低首先可以考慮是否加樣出現(xiàn)問題，試劑混合均勻問題、出現(xiàn)泊松分布，或者反應體系過大、液體超出反應孔平面，沒有使用ROX校準等。擴增曲線的斜率不一致一般而言，熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段，線性擴增階段和平臺期。只有在指數(shù)擴增期，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，選擇該階段進行定量分析。但如果在此階段擴增曲線的斜率出現(xiàn)不一致，則提示可能樣本不好，即可能存在乙醇、蛋白酶等抑制物?？捎梅止夤舛扔嫓y量樣品260/280比值，重新檢測樣品質(zhì)量。另外，也可以考慮是否是因為加樣不準確，標準品出現(xiàn)降解、引物設計不好等問題。如何判斷有無非特異性擴增在染料法實時熒光定量時，可以根據(jù)溶解曲線進行分析是否存在特異性擴增。如果出現(xiàn)單一峰且峰值在Tm值位置出現(xiàn)，證明沒有非特異性擴增，且初始模板沒有被污染；如果出現(xiàn)多個峰，估計是有非特異性擴增了或者初始模板被污染了。出現(xiàn)非特異性擴增，可能的原因有：樣本污染、引物特異性不好、形成了引物二聚體、鎂離子濃度過高等，根據(jù)可能出現(xiàn)的原因進行逐一排除分析，改變條件。因退火溫度引起的非特異性擴增，可以通過梯度PCR確定最佳退火溫度。另外，對于GC含量較高的片段，可以考慮加入適量二甲基亞砜（DMSO）提高DNA片段的特異性。熒光信號的讀取熒光信號的讀?。≒lateRead）是用來顯示PCR產(chǎn)物的濃度的，一方面來看，如果定量過程中發(fā)現(xiàn)PCR未出現(xiàn)擴增，不僅僅應該考慮模板或?qū)嶒灢僮鞯膯栴}，還需把產(chǎn)物進行電泳看看是否有條帶，以排除染料或探針的問題而導致的未讀取信號。另一方面，熒光信號的讀取一般延伸步驟，但如果在該步讀取熒光值總是出現(xiàn)非特征峰，可以考慮在后面加一步高溫步驟（約80-85度）讀取熒光值。熒光信號標準曲線的制作一般儀器很難做到100拷貝以下的準確定量，一般用來做標準曲線的最小濃度為1000拷貝，以確?？煽啃浴Ｆ渌麊栴}在實驗中特別要注意實驗的清潔，戴手套防止試劑污染。另外，也要注意儀器使用的規(guī)范，嚴格按照操作流程使用。先開電腦，待電腦完全啟動后再開啟定量PCR儀主機，等主機面板上的綠燈亮后即可打開定量PCR的收集軟件，進行實驗。確認實驗已經(jīng)結束后，首先關閉信號收集軟件，然后關掉定量PCR儀主機的電源，最后關閉電腦。參考文獻[1]周曉麗,朱國坡,李雪華,王艷玲,劉興友.實時熒光定量PCR技術原理與應用[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,02:87-89.[2]趙煥英,包金風.實時熒光定量PCR技術的原理及其應用研究進展[J].中國組織化學與細胞化學雜志,2007,04:492-497.[3]陳旭,齊鳳坤,康立功,李景富.實時熒光定量PCR技術研究進展及其應用[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2010,08:148-155.[4]劉小榮,張笠,王勇平.實時熒光定量PCR技術的理論研究及其醫(yī)學應用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,02:329-332.[5]CuiY,WangXJ,GaoS,etal.TheApplicationofReal-timeFluorescentQuantitativePCRinPlant[J].HubeiAgriculturalSciences,2015.[6]徐小剛,劉雅婷.實時熒光定量PCR在植物病害中的應用[J].中國農(nóng)學通報,2009,07:52-56.[7]王榮談,劉冬兒,厲建萌,張大兵,楊立桃.實時熒光定量PCR技術及其在植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中的應用[J].植物生理學通訊,2009,06:591-597.[8]馬月萍,戴思蘭,馬艷蓉.熒光定量PCR技術在植物研究中的應用[J].生物技術通報,2011,07:37-45.[9]程海星,郭月英,任霆,張靜,王樂,張利霞,靳燁.實時熒光定量PCR技術原理及在食品檢測中的應用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,03:243-247.[10]吳永彬,肖維威,馬文麗.實時熒光定量PCR技術在轉(zhuǎn)基因食品檢測領域中的應用[J].生物技術通訊,2011,22(4):575-579.[11]RodriguezlazaroD,HernandezM.Real-timePCRinFoodScience:Introduction.[J].CurrentIssuesinMolecularBiology,2013,15(2):25-38.[12]雷永良,王曉光,葉碧峰,等.實時熒光定量PCR技術在食品污染物監(jiān)測中的應用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2009(4):828-830.[13]趙潔,馬晨,席曉敏,張和平.實時熒光定量PCR技術在腸道微生物領域中的研究進展[J].生物技術通報,2014,12:61-66.[14]張晶,張惠文,張成剛.實時熒光定量PCR及其在微生物生態(tài)學中的應用[J].生態(tài)學報,2005,06:1445-1450.[15]王光華,趙偉春,程家安.實時熒光定量PCR技術及其在昆蟲學研究中的應用[J].昆蟲學報,2008,12:1293-1303.[16]NestorovJ,Mati?G,Elakovi?I,etal.GeneExpressionStudies:HowtoObtainAccurateandReliableDatabyQuantitativeReal-TimeRTPCR/IZU?AVANJEEKSPRESIJEG