核醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)：第二章 標(biāo)記免疫反應(yīng)分析

第二章標(biāo)記免疫反應(yīng)分析定義標(biāo)記免疫反應(yīng)分析是指在體外條件下，將已知抗體（抗原）標(biāo)記上示蹤物質(zhì)（標(biāo)記物），以免疫結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物來(lái)反映有無(wú)抗原抗體反應(yīng)，從而間接測(cè)定生物樣品中生物活性物質(zhì)含量的一類分析方法特點(diǎn)

該分析法將抗原抗體反應(yīng)的高特異性和標(biāo)記物檢測(cè)的高靈敏性有機(jī)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)機(jī)體內(nèi)超微量生物活性物質(zhì)的檢測(cè)分類

按反應(yīng)機(jī)制的不同，主要分為競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)和非競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)第一節(jié)競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)一、基本原理一定量的標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原

與有限量的特異抗體發(fā)生可逆性的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)平衡后分離出抗原抗體復(fù)合物，通過(guò)測(cè)量標(biāo)記復(fù)合物量來(lái)計(jì)算出非標(biāo)記抗原量。如：放射免疫分析法1、反應(yīng)體系中Ab是限量的，且一般為多克隆抗體2、Ag*、Ag免疫化學(xué)性質(zhì)相同，對(duì)特異性Ab具有相

同的結(jié)合及競(jìng)爭(zhēng)力3、Ag*及Ab的量保持恒定，且Ag*+Ag大于Ab的有效

結(jié)合位點(diǎn)4、Ag*Ab復(fù)合物的形成受Ag量的制約，隨著Ag濃度

的增加，Ag*Ab復(fù)合物形成減少二、技術(shù)條件三、技術(shù)特點(diǎn)1、待測(cè)抗原一般為小分子抗原或半抗原2、標(biāo)記物所標(biāo)記的物質(zhì)通常為抗原3、反應(yīng)體系中，標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原之和始終大

于加入的抗體量4、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式，求得待測(cè)抗原的含量5、待測(cè)Ag量與Ag*Ab量成反比函數(shù)關(guān)系6、加樣誤差對(duì)結(jié)果影響大7、待測(cè)抗原在低濃度時(shí)結(jié)果穩(wěn)定性和靈敏度相對(duì)較

好，而高濃度時(shí)則相反第二節(jié)非競(jìng)爭(zhēng)法免疫反應(yīng)在反應(yīng)系統(tǒng)中加入過(guò)量的標(biāo)記抗體(*Ab)，使未標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測(cè)抗原,Ag）與其進(jìn)行全量反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物。反應(yīng)平衡后分離出Ag-*Ab復(fù)合物并檢測(cè)活性，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出非標(biāo)記抗原的量如：雙抗體夾心法一、基本原理Ag+*AbAg*Ab+*Ab1、反應(yīng)體系中特異性Ab*始終是過(guò)量的，

能結(jié)合全部待測(cè)抗原（特殊情況除外）2、所用抗體一般為單克隆抗體二、技術(shù)條件三、技術(shù)特點(diǎn)1、待測(cè)抗原一般為大分子抗原2、標(biāo)記物所標(biāo)記的物質(zhì)通常為抗體3、反應(yīng)體系中所加標(biāo)記抗體的量始終大于抗原含量。4、待測(cè)Ag量與AgAb*量成正比例函數(shù)關(guān)系5、加樣誤差對(duì)結(jié)果影響僅來(lái)自標(biāo)本加樣6、待測(cè)抗原在低濃度時(shí)結(jié)果穩(wěn)定性和靈敏度相對(duì)較

差，高濃度時(shí)則相反7、測(cè)定結(jié)果的靈敏度、穩(wěn)定性和檢測(cè)線性范圍明顯

優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)法第三節(jié)標(biāo)記免疫分析技術(shù)

一、標(biāo)記免疫分析的技術(shù)優(yōu)勢(shì)1、特異性強(qiáng)：具有良好的特異結(jié)合試劑，能識(shí)別化學(xué)結(jié)構(gòu)上非

常相似的物質(zhì)，甚至能識(shí)別立體異構(gòu)體，能準(zhǔn)確測(cè)定生物活性

物質(zhì)的亞單位濃度。2、靈敏度高：可檢測(cè)水平為10-9~10-15g。一般化學(xué)分析法檢測(cè)

極限為10-3~10-6g。3、穩(wěn)定性好，精密度高：結(jié)果可重復(fù)性好。4、準(zhǔn)確度高：與真實(shí)值的差異小。5、應(yīng)用廣泛：目前至少有300多種生物活性物質(zhì)的檢測(cè)可應(yīng)用

標(biāo)記免疫分析法。如：激素、蛋白質(zhì)、抗體、免疫球蛋白、維

生素及藥物等。

二、標(biāo)記免疫分析的不足

1、被檢測(cè)物(抗原)超微量

穩(wěn)定性（包括校準(zhǔn)品、標(biāo)記物的穩(wěn)定性）理化性質(zhì)（肽類、氨基酸類、蛋白質(zhì)、糖蛋白類、

類固醇類、核酸類）抗原性表位數(shù)量異質(zhì)性（個(gè)體差異）標(biāo)準(zhǔn)品（統(tǒng)一性）受制因素：

標(biāo)記技術(shù)

免疫技術(shù)抗體選擇的差異

分離技術(shù)來(lái)源位點(diǎn)種屬單克隆、多克隆特異性效價(jià)親和力2、抗體3、標(biāo)記物吖啶酯發(fā)光（分子量：590）異魯米諾發(fā)光

（分子量：177）電化學(xué)發(fā)光三聯(lián)吡啶釕（分子量：748）酶促化學(xué)發(fā)光堿性磷酸酶分子量（56KD）125I(原子量：125）

磁微粒法

直接法(雙抗體夾心法采用)間接法(競(jìng)爭(zhēng)法、夾心法采用)生物素/鏈親和素-微粒:FITC/antiFITC-微粒：4、分離技術(shù)自身抗體氧化劑還原劑光線磁場(chǎng)金屬離子防腐劑雜質(zhì)血小板藥物5、干擾因素1、充分血凝2、充分離心常見干擾因素A、針對(duì)待測(cè)抗原的自身抗體自身抗體干擾通常會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的測(cè)試結(jié)果抗甲狀腺的自身抗體（即TSHAb或T4Ab）通過(guò)胎盤都有可能干擾新生兒激素檢測(cè)用競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)FT3、FT4時(shí)，T4Ab、T3Ab可引起假陽(yáng)性結(jié)果甲狀腺激素自身抗體的患病率在一般人群中接近2％自身免疫性甲狀腺疾病或其他自身免疫疾病的患者中可能高達(dá)30％造成錯(cuò)誤的高值結(jié)果B、嗜異性抗體（HA）人抗小鼠抗體(HAMA)，流行率為30-40％類風(fēng)濕因子(RF)最近接受疫苗注射、輸血或單克隆抗體治療以及接觸動(dòng)物的患者干擾主要影響使用鼠源單克隆抗體的非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法（夾心法）造成錯(cuò)誤的高值結(jié)果C、鏈霉親和素或生物素治療或攝入大劑量生物素或鏈霉親和素甲狀腺試劑組分含鏈霉親和素、生物素的容易受到干擾FT3\FT4假性升高，TSH假性降低*AgAg+Ab1*AgAb1AgAb1+Ab2*AgAb2AgAb21、PEG分離法：結(jié)果降低2、二抗分離法：結(jié)果升高3、固相一抗分離法：結(jié)果升高分析：

自身抗體對(duì)結(jié)果的影響（競(jìng)爭(zhēng)法）“干擾因素存在”判別思維要點(diǎn)判斷及證實(shí)“存在”很重要溝通：臨床、檢驗(yàn)、患者當(dāng)患者的臨床表現(xiàn)與檢測(cè)結(jié)果之間不一致時(shí)，應(yīng)首先懷疑自身抗體所造成的干擾存在基礎(chǔ)性疾病、妊娠、治療過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)法受影響程度明顯大于夾心法實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法：（1）標(biāo)本連續(xù)稀釋，觀察檢測(cè)濃度有無(wú)線性改變（2）標(biāo)本中加入標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收試驗(yàn)6、生產(chǎn)廠商因素很大程度上，廠家儀器、試劑質(zhì)量決定了臨床檢驗(yàn)質(zhì)量7、激素測(cè)定影響因素總結(jié)晝夜節(jié)律性：F、ALD、瘦素、GH、腎素、IGF-1患者狀態(tài)：情緒、應(yīng)激、運(yùn)動(dòng)、體位脈沖式分泌：大多數(shù)激素肝腎功能不全：性激素性別、年齡自主神經(jīng)系統(tǒng)：腎上腺髓質(zhì)激素、胃腸激素、胰高素標(biāo)本的保存與處理：分子量（催產(chǎn)素、血管緊張素）抽血時(shí)間與方式：固定時(shí)間，留置針自生抗體干擾：TGAb、INS-Ab、T4-Ab第四節(jié)標(biāo)記免疫分析技術(shù)性能評(píng)價(jià)一、分析性能評(píng)價(jià)指標(biāo)1、精密度（precision）2、準(zhǔn)確度（accuracy）3、靈敏度（Sensitivity）即能從生物樣品中檢出某物質(zhì)的最小濃度。4、穩(wěn)定性（Constancy）是體外診斷試劑隨著時(shí)間推移保持其特性一致

性的能力。5、特異性（Specificit）常用交叉反應(yīng)率（%）來(lái)表示。6、臨床可報(bào)告范圍臨床可報(bào)告范圍（clinicalreportablerange，CRR）是指對(duì)于超

過(guò)分析測(cè)量范圍（analyticalmeasurementrange，AMR）的分

析物，允許應(yīng)用樣本稀釋、濃縮和預(yù)處理分析方法測(cè)定樣本中分析

物的真實(shí)準(zhǔn)確的濃度。二、臨床診斷性能評(píng)價(jià)指標(biāo)（臨床有效性）1、臨床有效性是指一個(gè)測(cè)定項(xiàng)目完成臨床目的的程度。2、方法：

檢測(cè)方法建立進(jìn)行臨床觀察確定待測(cè)物質(zhì)參考值范圍

評(píng)價(jià)ROC曲線統(tǒng)計(jì)假陽(yáng)性率和假陰性率

3、ROC曲線以真陽(yáng)性率（靈敏度）為縱坐標(biāo)，假陽(yáng)性率（1－特異度）為橫坐標(biāo)，將相對(duì)應(yīng)的各個(gè)臨界值連接起來(lái)的曲線圖。

通過(guò)分別計(jì)算各個(gè)試驗(yàn)的ROC曲線下的面積（areaunderthecurve，AUC）進(jìn)行比較，AUC最大的試驗(yàn)，則其診斷效率最佳。在AUC＞0.5時(shí)，越接近1，說(shuō)明診斷效果越好。AUC在0.5~0.7時(shí)有較低的準(zhǔn)確性；AUC在0.7~0.9時(shí)有一定的準(zhǔn)確性；AUC在0.9以上時(shí)有較高的準(zhǔn)確性；AUC=0.5時(shí)，說(shuō)明該診斷試驗(yàn)完全無(wú)用。第五節(jié)臨床應(yīng)用一、本章小結(jié)二、案例分析某省室間質(zhì)控結(jié)果匯總，根據(jù)標(biāo)記兔疫反應(yīng)定量分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和不足，從中如何進(jìn)行評(píng)價(jià)？項(xiàng)目名稱所在組（化學(xué)發(fā)光）10年數(shù)據(jù)均值CV18年數(shù)據(jù)均值CVCA199A公司24342.1114.2841178.3311.87B公司699.0235.362283.7510.56C公司2095.0255.395158.695.66D公司5779.339.213152.378.88AFPA公司