(高清版)GBT 38477-2020 基因表達的測定 蛋白印跡法

ICS07.080基因表達的測定蛋白印跡法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T38477—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。育生物學研究所農業(yè)資源研究中心、中國醫(yī)科大學、河北師范大學。1GB/T38477—2020基因表達的測定蛋白印跡法1范圍本標準規(guī)定了用蛋白印跡(Westernblot)法測定基因表達的方法原理、試劑或材料、儀器設備、測定步驟和結果分析。本標準適用于動植物組織或體外培養(yǎng)細胞目的基因表達測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法下列術語和定義適用于本文件。3.1.1基因表達geneexpression將儲存在DNA分子中的遺傳信息經過轉錄和翻譯，轉變成具有生物活性的蛋白質分子的過程。下列縮略語適用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)ECL:增強型化學發(fā)光(EnhancedChemiluminescence)SDS:十二烷基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate)SDS:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis)TBS:Tris緩沖鹽溶液(TrisBufferedSaline)TBST:吐溫-20/Tris緩沖鹽溶液(Tween-20/TrisBufferedSaline)4原理SDS分離的蛋白質轉移到轉印膜上后，先用抗目的蛋白質的一抗與轉印膜上的蛋白質反25試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。GB/T6682,二級。5.31mol/LTris-鹽酸溶液稱取12.1gTris加入80mL水溶解，用鹽酸調至所需pH,加水定容至100mL。5.42mol/L氯化鈉溶液將117g氯化鈉加水溶解，定容至1000mL。5.50.5mol/L乙二胺四乙酸溶液稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉二水合物，加入80mL水，充分攪拌，用氫氧化鈉調pH至8.0,然后定容至100mL。5.6動物細胞/組織總蛋白裂解液取5mL1mol/LTris-鹽酸溶液(pH8.0)、7.5mL2mol/L氯化鈉溶液、1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液、1mL乙基苯基聚乙二醇、0.1g十二烷基硫酸鈉、1g脫氧膽酸鈉、加水定容至100mL。使用前加入蛋白酶抑制劑。5.7植物總蛋白抽提試劑盒含裂解液和蛋白酶抑制劑。將18.15gTris加入80mL水溶解，用1mol/L鹽酸調pH至8.8,加水定容至100mL。5.9丙烯酰胺溶液稱取29g丙烯酰胺單體和1gN,N'-甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL,過濾，置于棕色瓶，4℃避光保存，2個月內使用。5.100.1g/mL十二烷基硫酸鈉溶液稱取10g十二烷基硫酸鈉，加水溶解并定容至100mL,室溫保存。5.110.1g/mL過硫酸銨溶液稱取1g過硫酸銨，加水溶解并定容至10mL,分裝后，于—20℃保存。5.12蛋白濃度測定試劑盒含蛋白質標準品BSA和染料試劑。3GB/T38477—20205.145×SDS電泳緩沖液稱取23.5g甘氨酸和3.775gTris,加水溶解，定容至250mL。使用時按如下比例稀釋至使用濃5.16TBS溶液量取75mL2mol/L氯化鈉溶液和10mL1mol/LTris-鹽酸(pH7.5)緩沖液，加水定容至1L。5.17TBST溶液量取75mL2mol/L氯化鈉溶液、10mL1mol/LTris-鹽酸(pH水定容至1L。6.3垂直電泳槽。6.5平板搖床。6.7化學發(fā)光儀/紅外熒光成像系統(tǒng)。6.9真空干燥器。6.102.45mm超厚濾紙。6.111.5mL離心管。6.12磁力攪拌器。GB/T38477—2020解液(含蛋白酶抑制劑),振蕩器震蕩15s,冰浴5min,重復震蕩-冰浴30min后，4℃,12000r/min離心按照植物總蛋白提取試劑盒說明進行。7.2蛋白濃度的測定按照蛋白濃度測定試劑盒說明進行。測完蛋白濃度后，計算含100μg總蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品于離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×,將樣品于沸水中煮3min～5min使蛋白質變性。根據(jù)蛋白質相對分子質量大小選擇相應的SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度，參見附錄A。取7.3.1的蛋白樣品上樣，相鄰齒道加上標準分子量預染蛋白，空余齒道用1×上樣緩沖液補足體積。選擇電壓為8V/cm,當染料進入分離膠后，把電壓提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直到溴酚藍達到分離7.4轉膜將進行完SDS后的凝膠浸泡于轉膜緩沖液中30min。7.4.2半干法轉移蛋白質將轉印膜和兩張與轉印膜相同尺寸的濾紙于轉膜緩沖液中浸泡5min。由下至上安裝轉移裝置：陽極板—超厚濾紙—轉印膜—凝膠—超厚濾紙—陰極板，根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，根據(jù)目的蛋白相對分子量大小，轉移1.5h～3h。7.5封閉將轉印膜置于封閉液中，室溫搖動1h。7.6免疫反應將封閉后的轉印膜轉移到一抗工作液中，室溫下?lián)u動1h以上或4℃緩慢搖動過夜。棄去一抗工作液，用TBST搖動洗滌轉印膜3次，每次10min,最后用TBS搖動洗滌轉印膜5min。將轉印膜置于二抗工作液中，室溫下?lián)u動1h～3h。棄去二抗工作液，以TBST搖動洗滌轉印膜3次，每次10min,最后用TBS搖動洗滌轉印膜5min。457.7.1辣根過氧化物酶標記二抗的成像取ECL化學發(fā)光液A、B等量混勻，加在轉印膜上，避光顯色1min～5min,化學發(fā)光儀成像。7.7.2熒光標記二抗的成像利用熒光成像系統(tǒng)成像。8結果分析成像圖片本底干凈，能觀察到轉印膜均勻的輕微背景輪廓，目的條帶清晰且不過曝，即可判為目的蛋白表達。6GB/T38477—2020(資料性附錄)試劑配制A.1SDS分離膠根據(jù)所需濃度不同，按照表A.1配制。凝膠濃度溶液成分mL1.5mol/LTris-鹽酸(pH8.8)丙烯酰胺溶液0.1g/mL十二烷基硫酸鈉溶液過硫酸銨溶液四