(高清版)GBT 38477-2020 基因表達(dá)的測(cè)定 蛋白印跡法

ICS07.080基因表達(dá)的測(cè)定蛋白印跡法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T38477—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)、河北師范大學(xué)。1GB/T38477—2020基因表達(dá)的測(cè)定蛋白印跡法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用蛋白印跡(Westernblot)法測(cè)定基因表達(dá)的方法原理、試劑或材料、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟和結(jié)果分析。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)植物組織或體外培養(yǎng)細(xì)胞目的基因表達(dá)測(cè)定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1基因表達(dá)geneexpression將儲(chǔ)存在DNA分子中的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子的過(guò)程。下列縮略語(yǔ)適用于本文件。BSA:牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin)ECL:增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(EnhancedChemiluminescence)SDS:十二烷基硫酸鈉(SodiumDodecylSulfate)SDS:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis)TBS:Tris緩沖鹽溶液(TrisBufferedSaline)TBST:吐溫-20/Tris緩沖鹽溶液(Tween-20/TrisBufferedSaline)4原理SDS分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上后，先用抗目的蛋白質(zhì)的一抗與轉(zhuǎn)印膜上的蛋白質(zhì)反25試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭B/T6682,二級(jí)。5.31mol/LTris-鹽酸溶液稱取12.1gTris加入80mL水溶解，用鹽酸調(diào)至所需pH,加水定容至100mL。5.42mol/L氯化鈉溶液將117g氯化鈉加水溶解，定容至1000mL。5.50.5mol/L乙二胺四乙酸溶液稱取18.61g乙二胺四乙酸二鈉二水合物，加入80mL水，充分?jǐn)嚢?，用氫氧化鈉調(diào)pH至8.0,然后定容至100mL。5.6動(dòng)物細(xì)胞/組織總蛋白裂解液取5mL1mol/LTris-鹽酸溶液(pH8.0)、7.5mL2mol/L氯化鈉溶液、1mL0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液、1mL乙基苯基聚乙二醇、0.1g十二烷基硫酸鈉、1g脫氧膽酸鈉、加水定容至100mL。使用前加入蛋白酶抑制劑。5.7植物總蛋白抽提試劑盒含裂解液和蛋白酶抑制劑。將18.15gTris加入80mL水溶解，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至8.8,加水定容至100mL。5.9丙烯酰胺溶液稱取29g丙烯酰胺單體和1gN,N'-甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL,過(guò)濾，置于棕色瓶，4℃避光保存，2個(gè)月內(nèi)使用。5.100.1g/mL十二烷基硫酸鈉溶液稱取10g十二烷基硫酸鈉，加水溶解并定容至100mL,室溫保存。5.110.1g/mL過(guò)硫酸銨溶液稱取1g過(guò)硫酸銨，加水溶解并定容至10mL,分裝后，于—20℃保存。5.12蛋白濃度測(cè)定試劑盒含蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品BSA和染料試劑。3GB/T38477—20205.145×SDS電泳緩沖液稱取23.5g甘氨酸和3.775gTris,加水溶解，定容至250mL。使用時(shí)按如下比例稀釋至使用濃5.16TBS溶液量取75mL2mol/L氯化鈉溶液和10mL1mol/LTris-鹽酸(pH7.5)緩沖液，加水定容至1L。5.17TBST溶液量取75mL2mol/L氯化鈉溶液、10mL1mol/LTris-鹽酸(pH水定容至1L。6.3垂直電泳槽。6.5平板搖床。6.7化學(xué)發(fā)光儀/紅外熒光成像系統(tǒng)。6.9真空干燥器。6.102.45mm超厚濾紙。6.111.5mL離心管。6.12磁力攪拌器。GB/T38477—2020解液(含蛋白酶抑制劑),振蕩器震蕩15s,冰浴5min,重復(fù)震蕩-冰浴30min后，4℃,12000r/min離心按照植物總蛋白提取試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。7.2蛋白濃度的測(cè)定按照蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。測(cè)完蛋白濃度后，計(jì)算含100μg總蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品于離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×,將樣品于沸水中煮3min～5min使蛋白質(zhì)變性。根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小選擇相應(yīng)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度，參見(jiàn)附錄A。取7.3.1的蛋白樣品上樣，相鄰齒道加上標(biāo)準(zhǔn)分子量預(yù)染蛋白，空余齒道用1×上樣緩沖液補(bǔ)足體積。選擇電壓為8V/cm,當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15V/cm,繼續(xù)電泳直到溴酚藍(lán)達(dá)到分離7.4轉(zhuǎn)膜將進(jìn)行完SDS后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中30min。7.4.2半干法轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)將轉(zhuǎn)印膜和兩張與轉(zhuǎn)印膜相同尺寸的濾紙于轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5min。由下至上安裝轉(zhuǎn)移裝置：陽(yáng)極板—超厚濾紙—轉(zhuǎn)印膜—凝膠—超厚濾紙—陰極板，根據(jù)凝膠面積按0.65mA/cm2接通電流，根據(jù)目的蛋白相對(duì)分子量大小，轉(zhuǎn)移1.5h～3h。7.5封閉將轉(zhuǎn)印膜置于封閉液中，室溫?fù)u動(dòng)1h。7.6免疫反應(yīng)將封閉后的轉(zhuǎn)印膜轉(zhuǎn)移到一抗工作液中，室溫下?lián)u動(dòng)1h以上或4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。棄去一抗工作液，用TBST搖動(dòng)洗滌轉(zhuǎn)印膜3次，每次10min,最后用TBS搖動(dòng)洗滌轉(zhuǎn)印膜5min。將轉(zhuǎn)印膜置于二抗工作液中，室溫下?lián)u動(dòng)1h～3h。棄去二抗工作液，以TBST搖動(dòng)洗滌轉(zhuǎn)印膜3次，每次10min,最后用TBS搖動(dòng)洗滌轉(zhuǎn)印膜5min。457.7.1辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗的成像取ECL化學(xué)發(fā)光液A、B等量混勻，加在轉(zhuǎn)印膜上，避光顯色1min～5min,化學(xué)發(fā)光儀成像。7.7.2熒光標(biāo)記二抗的成像利用熒光成像系統(tǒng)成像。8結(jié)果分析成像圖片本底干凈，能觀察到轉(zhuǎn)印膜均勻的輕微背景輪廓，目的條帶清晰且不過(guò)曝，即可判為目的蛋白表達(dá)。6GB/T38477—2020(資料性附錄)試劑配制A.1SDS分離膠根據(jù)所需濃度不同，按照表A.1配制。凝膠濃度溶液成分mL1.5mol/LTris-鹽酸(pH8.8)丙烯酰胺溶液0.1g/mL十二烷基硫酸鈉溶液過(guò)硫酸銨溶液四