《人全血糖化血紅蛋白檢測-基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法-標準編制說明》

一、工作簡況

1、背景

糖化血紅蛋白是2型糖尿病診斷以及病情監(jiān)測的關(guān)鍵指標。因型糖尿病患者

眾多，因此其檢驗量巨大。目前，該檢測方法主要以高效液相色譜法等方法為主，

相關(guān)核心技術(shù)來源于國外，并且效率低、成本高、抗干擾能力差。本標準特選擇

檢測效率高、成本低、抗干擾能力強的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)

進行糖化血紅蛋白的檢測，該技術(shù)適用于檢測通量高、成本控制要求嚴格的檢驗

環(huán)境，并且該方法抗干擾能力強，尤其適用于我國復(fù)雜的血紅蛋白變異環(huán)境，屬

于我國自主創(chuàng)新技術(shù)，有極大的推廣意義。

《人全血糖化血紅蛋白檢測—基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法》系融

智生物科技（青島）有限公司等企業(yè)在所研制生產(chǎn)的“新一代寬譜定量飛行時間

質(zhì)譜平臺QuanTOF”的基礎(chǔ)上，開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù)的糖化血

紅蛋白質(zhì)譜定量檢測方法。2021年1月，融智生物科技（青島）有限公司等單

位起草完成了《人全血糖化血紅蛋白檢測—基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜

法》企業(yè)標準（企業(yè)標準號QB-IntelliBio-012-2021），并于2021年2月1日開始

實施。上述標準制訂參與企業(yè)并進一步推廣該方法為團體標準等工作。2022年，

相關(guān)文件提交中國分析測試協(xié)會及中關(guān)村材料試驗技術(shù)聯(lián)盟申報團體標準。

2、起草單位、起草人（按拼音排序）

A、起草單位：

北京大學深圳醫(yī)院、北京融智優(yōu)譜生物科技有限公司、廣東默迪優(yōu)譜生物科

技有限公司、杭州意誠默迪生物科技有限公司、南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院、融智生

物科技（青島）有限公司、上海伍豐科學儀器有限公司、首都醫(yī)科大學附屬北京

朝陽醫(yī)院、煙臺大學生命科學院、中國科學院生物物理研究所；

B、主要起草人：

紀玲、李晨、李巖、李運濤、馬昱、宋合興、孫德慧、孫朋衛(wèi)、王緒敏、王

玉璽、溫斌斌、吳軼、謝雯春、徐安平、張瑞、周宏偉、周曉光

二、標準編制原則和確定標準的依據(jù)

本標準編制過程中參考或引用了以下相關(guān)標準：

GB/T191包裝儲運圖示標志

GB4793.1測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全要求第1部分：通用要

求

GB4793.6-2008測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全要求第6部分:實驗

室用材料加熱設(shè)備的特殊要求

GB4793.9測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全要求第9部分：實驗室

用分析和其他目的自動和半自動設(shè)備的特殊要求

GB7247.1激光產(chǎn)品的安全第1部分：設(shè)備分類、要求

GB/T14710醫(yī)用電氣環(huán)境要求及試驗方法

GB/T18268.1測量、控制和實驗室用的電設(shè)備電磁兼容性要求第1部分：

通用要求

GB/T18268.26測量、控制和實驗室用的電設(shè)備電磁兼容性要求第26部

分：特殊要求體外診斷(IVD)醫(yī)療設(shè)備

YY0648測量、控制和實驗室用電氣設(shè)備的安全要求第2-101部分：體外

診斷（IVD）醫(yī)用設(shè)備專用要求

GB/T21415—2008體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測量校準品和控制

物質(zhì)賦值的計量學溯源性

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

GB/T38576-2020人類血液樣本采集與處理

JJF1528-2015飛行時間質(zhì)譜儀校準規(guī)范

WS/T461-2015中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《糖化血紅蛋白檢測》

當前國內(nèi)外共有數(shù)十家基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀研發(fā)、生產(chǎn)和

相關(guān)技術(shù)開發(fā)企業(yè)，但不同企業(yè)提供的質(zhì)譜儀性能存在差異，尤其是對蛋白大分

子的靈敏度、質(zhì)量分辨能力和線性范圍，以及定量重現(xiàn)性能力不均，這些性能將

極大地影響到基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜對糖化血紅蛋白檢測的能力，

因此，本標準規(guī)范了基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀的相關(guān)基礎(chǔ)性能要求

以及檢測方法學流程等，并參考和引用了國家標準、行業(yè)標準中對糖化血紅蛋白

檢測儀、糖化血紅蛋白檢測方法的相關(guān)規(guī)范。

三、標準制定的主要內(nèi)容

1、范圍的確定

擬制定的標準適用于人全血中糖化血紅蛋白的相對含量測定。

2、人全血糖化血紅蛋白含量測定方法及指標的確定

目前常用的人全血糖化血紅蛋白相對含量測定方法包括高效液相色譜法、電

泳法以及免疫測定法等，其中IFCC（國際臨床化學和實驗室醫(yī)學聯(lián)盟）以液相

色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法作為參考方法。

目前已使用的各種方法中，較適宜臨床使用的主要是高效液相色譜法等，但

人類血紅蛋白情況復(fù)雜，尤其是我國跨越緯度較高，不同緯度人群血紅蛋白的差

異明顯，尤其是我國南方地區(qū)。這些差異造成現(xiàn)有方法存在較大測試干擾，因而

對進一步的確診、精準治療都有影響。

擬起草的標準采用了MALDI-TOFMS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)

譜法），并分析了常見干擾情況，對現(xiàn)有方法在抗干擾以及精準醫(yī)療等方面進行

了延伸。

3、正確度、精密度測試

擬起草的標準在測試正確度、精密度等方面引用了WS/T461-2015《糖化血

紅蛋白檢測》的相關(guān)要求。

3.1精密度驗證

2個濃度水平質(zhì)控物分別每天重復(fù)測定3次，共5天，統(tǒng)計均值、標準差和

變異系數(shù)（CV）。按照CLSIEP15-A評價方案，室內(nèi)變異系數(shù)（CV)小于3%，

以小于2%為宜。

注：（1）目前許多測定方法的室內(nèi)CV小于2%。

（2）只有控制室內(nèi)CV小于2%，才能實現(xiàn)室間CV小于3.5%。

（3）HbA1C測定質(zhì)量目標：小于0.5%HbA1C。

3.2正確度

至少兩個水平標準物質(zhì)，每個水平標準物質(zhì)3個平行樣本，每個樣本重復(fù)測

定6次。與可接受參考值的差值在±0.5%HbA1c范圍內(nèi)，以控制±0.3%HbA1c

范圍內(nèi)為宜。正確度驗證方法，包括但不限于以下方式：

-參加室間質(zhì)量評價（能力驗證）計劃；

-采用恰當?shù)挠凶C標準物質(zhì)；

-與運行經(jīng)過認證分析系統(tǒng)的有資質(zhì)實驗室的測定結(jié)果進行比對。

3.3線性

在檢測區(qū)間范圍內(nèi)，檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于0.990。

本標準所載的方法經(jīng)融智生物科技（青島）有限公司以及煙臺大學生命科學

院、中國農(nóng)業(yè)大學信息獲取重點實驗室、安徽皖測食品檢測公司、上海市食品研

究所、北京大學深圳醫(yī)院等實驗室進行高、中、低值的三個樣本平行比對實驗，

測試結(jié)果滿足WS/T461-2015對準確度以及相對偏差等的要求。結(jié)果見下表：

糖化值測試值

實驗室樣本偏差（%）

（%）（%）

A14.84.80

煙臺大學

A210.4110.450.3842459

生命科學院

A316.0916.06-0.186451

中國農(nóng)業(yè)A14.84.79-0.208333

大學信息獲取A210.4110.420.0960615

重點實驗室A316.0916.04-0.310752

A14.84.810.2083333

安徽皖測

A210.4110.470.5763689

食品檢測公司

A316.0916.10.0621504

A14.84.79-0.208333

上海市食

A210.4110.39-0.192123

品研究所

A316.0916.05-0.248602

A14.84.912.2916667

北京大學

A210.419.94-4.51489

深圳醫(yī)院

A316.0915.48-3.791175

4、抗干擾和異常樣本測試情況

抗干擾能力及糖化血紅蛋白變體情況評估

表1.QuanTOF用于糖化血紅蛋白定量分析抗干擾評估

InterferencesBias,%Bias,mmol/mol

Bilirubin(≤304.0μ

≤0.1≤1

mol/L)

Triglycerides(≤22.8

≤0.1≤1

mmol/L)

cHb(≤8.7%)≤0.2≤2

LabileA1c(≤12.2%)≤0.2≤2

HbF(≤8.0%)≤0.2≤2

HbF(>8.0%)>0.2>2

HbJ-Bangkok-0.24

HbCoushatta-0.21

HbG-Taipei≤0.1

HbQ-Thailand-0.27

HbG-Honolulu≤0.2

HbAS:qualityseparationSglobinchainseparatedfromotherfractions

TruenessHbA1c(n=2)0.5,0.45,4

HbAC:quality

CglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=3)≤0.2≤2

HbAD:quality

DglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=5)≤0.2≤2

HbAE:quality

EglobinchaincoeluteswithHbA

separation

TruenessHbA1c(n=10)≤0.2≤2

A.1不穩(wěn)定糖化血紅蛋白

測定3例樣本的紅細胞的糖化血紅蛋白值，包括正常水平(4.8%；29

mmol/mol)，中等水平(6.6%；49mmol/mol)，和高等水平(10.0%；86mmol/mol)。

將這三個樣本與葡萄糖溶液在37℃下孵育1.5小時，每30分鐘測一次糖化血紅

蛋白HbA1c和不穩(wěn)定的HbA1c。不穩(wěn)定的HbA1c用VariantIIAnalyzer定量分析，

計算不穩(wěn)定HbA1c濃度的偏差。結(jié)果表明，MALDI-TOF質(zhì)荷比在15000~16000

范圍內(nèi)沒有檢測到被修飾的血紅蛋白。質(zhì)譜定量值與基準HbA1c值相比，即使

不穩(wěn)定HbA1c比例高達12.2%，不同持續(xù)時間葡萄糖處理樣本的HbA1c水平偏

差均在0.2%（3mmol/mol）以內(nèi)（見表1）。

A.2氨甲酰血紅蛋白（cHb）

氨甲酰血紅蛋白對于HbA1c的干擾是通過上述4.5.1中三個樣本進行評估的。

紅細胞與氰酸鉀（1mmol/mol），37℃下孵育3小時。HbA1c和cHb每小時測一

次。cHb由VariantIIAnalyzer定量分析，將含有不同cHb濃度的樣本的HbA1c

值與基線HbA1c進行比較。經(jīng)氰酸鉀處理后，在質(zhì)譜圖中，即使氨甲酰血紅蛋

白高達8.7%，也未對結(jié)果產(chǎn)生有統(tǒng)計學意義的影響（見表1）。

A.3膽紅素和甘油三酯

用糖化血紅蛋白為正常濃度（5.6%，38mmol/mol）和高濃度（8.7%，72

mmol/mol）的兩個樣本來評估甘油三酯和膽紅素的影響。兩個樣本的紅細胞與

不同濃度的甘油三酯和膽紅素血漿混合，使甘油三酯和膽紅素的終濃度分別為

22.8mmol/L和304.0μmol/L。膽紅素和甘油三酯濃度分別達到304.0mol/L和22.8

mmol/L時，未對結(jié)果產(chǎn)生有統(tǒng)計學意義的影響（見表1）。

A.4影響β珠蛋白含量計算的特殊變體干擾

除了基于常規(guī)β鏈糖基化對HbA1c進行定量分析外，實驗數(shù)據(jù)還表明，使

用α鏈糖基化計算的HbA1c值與Ultra2結(jié)果之間具有良好的一致性，因此支持使

用α鏈糖基化來評估HbA1c的水平。最重要的發(fā)現(xiàn)是，通過使用α鏈糖基化可以

完全克服由于β鏈變體的存在而對HbA1c的測量造成的干擾。類似地，通過使用

β鏈糖基化可以消除由α鏈糖基化產(chǎn)生的臨床上顯著的干擾。顯而易見的原因是由

于兩者之間存在足夠的質(zhì)量差異，變體β鏈無法同時影響α鏈及其糖基化形式，反

之亦然。

當檢測樣本存在影響β珠蛋白含量計算的特殊變體干擾時，可通過公式（3）

進行。以HBF為例，HbF對于HbA1c定量的干擾評估是通過臍帶血與三個樣本

進行混合，這三個樣本HbA1c的濃度分別為正常水平（5.6%，38mmol/mol），

中等水平（6.7%，50mmol/mol），高水平（9.2%，77mmol/mol）。通過Capillarys3

TERA的測定HbF水平為0.8%~14.2%。HbF存在時，質(zhì)譜圖中出現(xiàn)γ-珠蛋白鏈

（m/z=15,997.4）峰（見圖2）。HbF在低于8.0%時不會顯著影響糖化血紅蛋白

定量結(jié)果。當HbF含量大于約8.0%時，HbA1c值的偏差超過0.2%（2mmol/mol）。

此外，隨著HbF百分比的增加，偏差也隨之增加（見表1）。此時，糖化比率計

算方式可更換為以下公式：

血紅蛋白糖化率計算公式：

……（3）

?????α??

?式?中?1：?%=?α×?????α??+?α??+?α

A——斜率

B——常數(shù)

SGαlc-αHb——糖化α-Hb的峰面積

SααHb——非糖化α-Hb的峰面積

表2.QuanTOF定量分析血紅蛋白變體

Population

VariantMassDetectable

Hbvariantfrequency

chaindifference/DabyQuanTOF

inChina

HbHamiltonβchain14Yes0.015%

HbNewYorkβchain30Yes0.143%

HbJ-Bangkokβchain58Yes0.020%

HbSanDiegoβchain32Yes0.005%

HBBc.41C>Tβchain28Yes0.005%

HbBinyangαchain16Yes0.005%

HbPhnomPenhαchain113Yes0.025%

HbQ-Thailandαchain22Yes0.035%

HbG-Coushattaβchain-58Yes0.010%

HbAmsterdamαchain-18Yes0.0049%

HbHekinanαchain-14Yes0.119%

HbRushβchain-1No0.005%

A.5其他常見血紅蛋白變體

很多血紅蛋白變體并未影響本方法的測試結(jié)果。通過樣品分析研究了血紅蛋

白變異的干擾，這些樣本包括HbAS（n=2）,HbAD（n=5）,HbAC（n=3），和

HbAE（n=10）。所有雜合血紅蛋白變異均通過Sanger測序確認。用QuanTOF和

硼酸鹽親和高效液相色譜法（Ultra2,TrinityBiotech）測定其變異。用這兩種方法

進行比較是因為硼酸鹽親和作用的結(jié)果被認為不受血紅蛋白變異的影響。隨后用

QuanTOF測得的HbA1c值和與Ultra2