飼料中牛、綿羊和山羊源性成分的定性檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法 編制說(shuō)明

定性檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》（征求意見稿） 1 1 1 1 5 6 7 7 7 8 8 9 9 11 2.3.8絕對(duì)檢測(cè)限（Absolutelimitofdetection)測(cè)試 2.3.9相對(duì)檢測(cè)限（Relativelimitofdetection)測(cè)試 2.3.10方法的穩(wěn)健性（Robust 32 32 33 1根據(jù)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2023年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審修訂計(jì)劃的通瘋牛病(BSE)是發(fā)生在成年牛的一種慢性進(jìn)行性高致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬表1我國(guó)主要?jiǎng)游镌葱猿煞謾z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)匯總飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法常見畜禽動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法熒光PCR法熒光PCR法2熒光PCR法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)普通牛(Bostaurus)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因定性黃羊源性成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法牛和山羊源性成分同步檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法牛和馬源性成分同步檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法牛和豬源性成分同步檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法馬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法綿羊和山羊源性成分同步檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法飼料中羊源性成分檢測(cè)方法（熒光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法動(dòng)物產(chǎn)品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法食品中馬、驢源性成分定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法食品中雞、鴨源性成分定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法》。但該標(biāo)準(zhǔn)存3山羊完全配對(duì)，與綿羊相差7個(gè)堿基，會(huì)導(dǎo)致綿羊成分漏檢。上?？诎对?003年曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)SN/T1119-2002標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)重缺陷，重新設(shè)計(jì)綿羊的引物，連續(xù)從價(jià)在海關(guān)日常的進(jìn)口飼料檢測(cè)中，檢測(cè)人員使用檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《SN/T2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法》檢測(cè)出牛羊成分出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果需要退貨或銷毀時(shí)，客戶會(huì)提出使用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T1Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢42Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR3Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR4Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR5Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR6Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR7Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR8Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法第8部分—火雞DNA檢測(cè)方法9Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR本項(xiàng)目修改采用建議參照ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、5產(chǎn)品的質(zhì)量安全，促進(jìn)我國(guó)飼料工業(yè)、畜牧業(yè)和水光PCR法》制定任務(wù)后，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)的具體工作進(jìn)行了認(rèn)真研究，確定了總體工6 2024年6月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組完成標(biāo)準(zhǔn)文本、編制說(shuō)明定向征求意見稿編制7該標(biāo)準(zhǔn)在具有質(zhì)量控制及檢驗(yàn)水平的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)可以使用便于檢測(cè)該檢測(cè)方法的相對(duì)檢測(cè)下限為0.1%（W/W)，絕對(duì)檢測(cè)下限均為5拷貝參考ISO/TS20224-1:2020《分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成2020《分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法第2部分—綿羊DNA檢測(cè)方法》、ISO/TS20224-5:2020《分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法第5部分—山羊8DNA檢測(cè)方法》，開展方法學(xué)研究，建立了《飼料中牛、綿羊和山羊源性成分的定性檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法》。DNA提取試劑或DNA提取試劑盒、熒光定量PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)配套試劑、蛋條引物配制成400nmol/L儲(chǔ)存液，將每條引物探針配制成200nmol/L儲(chǔ)存液，表3引物探針序列目標(biāo)物種引物探針編號(hào)序列基因序列號(hào)18SrRNA參照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’XR_003508809.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA參照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’18SrRNA參照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’18SrRNA參照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’牛Bov-62bp-FF:5′-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3′NC_037352.1Bov-62bp-RR:5′-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3′Bov-62bp-PP:5′-[FAM]-AGGTGCACAGTACGTTC-[NFQ-MGB]-3′綿羊Ovine-88bp-F5’-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3’AF041979.1Ovine-88bp-R5’-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3’Ovine-88bp-P5’-[FAM]-TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTC-[TAMRA]-3’Goat-87bp-F5’-GGAAGGAAAGAGAATGGGGATATGG-3’NC_030816.1Goat-87bp-R5’-TCTCCACACACAGCCAAAACC-3’Goat-87bp-P5’-[FAM]-ATCCATCTCTCCCTCCACTCCCTGCCTAA-[TAMRA]-3’9定儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Eppendorf5425小型臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德國(guó)Memeert公司）；SPEX6850型冷凍碾磨機(jī)（美國(guó)SPEXSamplePrep公司）；QX1）；國(guó)產(chǎn)精補(bǔ)飼料陽(yáng)性樣品的制備：使用犢牛精料補(bǔ)充料，分別添加5%含量的國(guó)產(chǎn)濃縮飼料陽(yáng)性樣品的制備：使用種豬濃縮飼料，分別添加5%含量的牛國(guó)產(chǎn)配合飼料陽(yáng)性樣品的制備：使用對(duì)蝦配合飼料，分別添加5%含量的牛為了保持檢測(cè)結(jié)果的一致性和提取方法的簡(jiǎn)便性，本研究所用的DNA提取方法，除比較核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表4PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系—表5PCR反應(yīng)程序反應(yīng)溫度反應(yīng)時(shí)間循環(huán)數(shù)預(yù)變性95℃10mins1熱循環(huán)（擴(kuò)增）95℃4060℃通過(guò)檢測(cè)內(nèi)參基因真核生物18SrRNA基因，可以判斷樣品所提取的DNA是否適合于PCR擴(kuò)增。但目前關(guān)于18SrRNA基因檢測(cè)，空白對(duì)照出現(xiàn)擴(kuò)增曲實(shí)驗(yàn)樣品包括：18種動(dòng)物肉類、3種植物種子、3種細(xì)菌（原核生物），表618SrRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品1鴿23馬4驢5螺678雞9豬鵝鴨貓鹿狗陰性對(duì)照（細(xì)菌）、空白對(duì)照（水）也會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增，檢測(cè)Ct值區(qū)域見表7。表7四套引物和探針檢測(cè)Ct區(qū)域比較1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探針進(jìn)行檢測(cè)，在樣品之間，陰性對(duì)照（金葡球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等原核生物）和空白對(duì)照在表8檢測(cè)18SrRNA各樣品的Ct值Ct值樣品123456789均值1普通牛21.1021.1220.3421.0320.1520.8721.1721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0821.1220.3421.0420.2120.1920.4821.3320.623馬20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驢19.0119.8819.5620.0120.3919.1819.7520.3319.8419.0719.705螺19.1219.8319.3220.2119.8720.4720.1919.5620.1419.3919.816綿羊20.1619.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078雞21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339豬22.3522.3421.8922.7821.0922.1721.3922.7722.2922.0322.11鵝20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鴨18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99貓24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火雞20.3621.2221.3220.1821.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.1721.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81駱駝20.7120.3921.1621.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.1720.6920.3319.0620.3519.7819.78鴿19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022豬皮明膠31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.1432.3331.8431.6023明膠藥殼28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.1325.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4126.1225.8825.9225.4725.9625.7827曲奇餅干20.8120.0820.1220.1720.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.1732.3932.3332.1733.4533.1332.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0533.1832.5832.1133.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙門氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大腸桿菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControlO)40.1940.7740.1737.1537.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大連寶生物、華大基因、上海英駿生物技術(shù)有限公司、ThermoFisherScientific（3）本研究將上海生工生物工程公司合成的引物和探針干粉直接寄至上海本項(xiàng)目在深入研究的基礎(chǔ)上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq），物探針組對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序表9樣品DNA稀釋濃度及對(duì)應(yīng)Ct值123456利用數(shù)字PCR對(duì)梯度稀釋的樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果顯示，該結(jié)果同實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果保持一致，說(shuō)明有效區(qū)分陽(yáng)表10數(shù)字PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)總體積樣品4正/反引物探針0.5PCR擴(kuò)增酶混合物水表11樣品濃度與拷貝數(shù)12345622注釋:“---”超出檢測(cè)線性范圍拷貝數(shù)明顯高于牛細(xì)胞，前者高于后者60倍左右。taurus)、印度瘤牛(Bosindicus)、美洲野牛Bison(Bisonb檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；使用綿羊的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)，綿羊(Ovisaries)的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，使用山羊的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)，山羊(Caprahirc表1218SrRNA、牛、綿羊、山羊檢測(cè)方法特異性測(cè)試物種種類動(dòng)物普通牛(Bostaurus)++--印度瘤牛(Bosindicus)++--美洲野牛(Bisonbison)++--牦牛(Bosmutus)++--綿羊(Ovisaries)+-+-山羊(Caprahircus)+--+駱駝(Camelusbactrianus)+---鯉魚(Cyprinuscarpio)+---貓(Feliscatus)+---雞(Gallusgallus)+---狗(Canisfamiliaris)+---驢(Equusasinus)+---鴨(Anasplatyrhynchos)+---麋鹿(Cervuscanadensis)+---金魚(Carassiusauratus)+---鵝(Anseranser)+---馬(Equuscaballus)+---小鼠(Musmusculus)+---恒河猴(Macacamulata)+- -鴕鳥(Struthiocamelus)+---野雞(Phasianuscolchicus)+---豬(Susscrofadomesticus)+---野豬(Susscrofa)+---鴿(Columbalivia)+---鵪鶉(Coturnixcoturnix)+---兔(Oryctolaguscuniculus)+ -大鼠(Ratusnorvegicus)+---虹鱒魚(Onchorhynchusmykiss)+---火雞(Meleagrisgallopavo)+- -水牛(Bubalusbubalis)+---人(Homosapiens)+---植物苜蓿(Medicagosativa)+- -玉米(Zeamays)+---油菜(Brassicarapa)+---大米(Oryzasativa)+---高粱(Sorghumbicolor)+- -大豆(Glycinemax)+---小麥(Triticumaestivum)+---2.3.8絕對(duì)檢測(cè)限（Absolut術(shù)對(duì)克隆質(zhì)粒的拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量檢測(cè)，準(zhǔn)確稀釋到1000拷貝/μL。將定量測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所建立的牛、綿羊、山羊成分PCR檢測(cè)方法在DNA濃度為1拷貝/μL（5拷貝/PCR反應(yīng)）時(shí)都能1說(shuō)明所建立的牛、綿羊、山羊成分PCR檢測(cè)方法的絕對(duì)檢測(cè)限可達(dá)5拷貝/PCR表13牛、綿羊、山羊檢測(cè)方法的絕對(duì)檢測(cè)限測(cè)試牛DNA濃度/（拷貝/μL）靶序列拷貝數(shù)/（拷貝/PCR反陽(yáng)性結(jié)果百分比（%)貝/μL）貝數(shù)/（拷貝/PCR反陽(yáng)性結(jié)果百分（%)DNA濃度/（拷貝/μL）貝數(shù)/（拷貝/PCR反應(yīng)）陽(yáng)性結(jié)果百分比（%)4442221515152221112.3.9相對(duì)檢測(cè)限（Relativ20表14牛、綿羊、山羊檢測(cè)方法的相對(duì)檢測(cè)限測(cè)試牛質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0150.0%0.0141.7%0.0133.3%0.0010%0.0010.0%0.0010%使用牛、綿羊、山羊PCR成分檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所建立的牛、綿羊、），表15牛、綿羊、山羊檢測(cè)方法的相對(duì)檢測(cè)限測(cè)試牛質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)質(zhì)量百分比陽(yáng)性結(jié)果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0125.0%0.0150.0%0.0141.7%210.0010%0.0010.0%0.0010%表16不同儀器型號(hào)對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響儀器型號(hào)牛ABI7500+++BioRadCFX96+++ABI7900HTFast+++EppendorfRealplex4+++表17不同反應(yīng)體積對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響反應(yīng)體積(μL）牛+++20+++21+++本項(xiàng)目用了三種不同的退火溫度（59、60、61℃)分別對(duì)牛、綿羊、山羊表18不同退火溫度對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響退火溫度(℃)牛2259+++60+++61+++表19不同引物探針濃度對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響引物探針工作液濃度(μmol/L）加樣體積(μL）牛上游引物1+++上游引物1探針0.5上游引物0.85+++上游引物0.85探針0.425上游引物0.7+++上游引物0.7探針0.35以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，所建立的牛、綿羊、山分檢測(cè)，結(jié)果如表20所示，表明這些方法適23表20實(shí)際飼料樣品的檢測(cè)牛1 234 56 78924 12 25 料 料 26 用修訂前標(biāo)準(zhǔn)的方法，未檢測(cè)出綿羊成分（見表21）。表21修訂后標(biāo)準(zhǔn)和修訂前標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果比較樣品檢測(cè)項(xiàng)目本方法GB/T20190-2006是否一致種豬濃縮飼料+5%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致種豬濃縮飼料+5%含量的綿羊肉骨粉綿羊源性成分+-不一致種豬濃縮飼料+5%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的綿羊肉骨粉綿羊源性成分+-不一致種豬濃縮飼料+1%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致2.6不同DNA提取方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響比較5%含量的牛肉骨粉、5%含量的綿羊肉骨粉、5%含量的山羊肉骨粉、1%含量的27表22不同DNA提取方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響比較序號(hào)名稱牛DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取1種豬濃縮飼料+5%含量的牛肉骨粉2種豬濃縮飼料+5%含量的綿羊肉骨粉3種豬濃縮飼料+5%含量的山羊肉骨粉4種豬濃縮飼料+1%含量的牛肉骨粉5種豬濃縮飼料+1%含量的綿羊肉骨粉6種豬濃縮飼料+1%含量的山羊肉骨粉來(lái)西亞、美國(guó)、葡萄牙、中國(guó)在內(nèi)的6個(gè)國(guó)家分兩次進(jìn)行國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)，12個(gè)表23假陽(yáng)性、假陰性率測(cè)試樣品牛28參加協(xié)同實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量提交結(jié)果的實(shí)驗(yàn)室數(shù)量每個(gè)實(shí)驗(yàn)室收到的樣品數(shù)量總樣品數(shù)量含有檢測(cè)靶序列的樣品數(shù)量787872不含檢測(cè)靶序列的樣品數(shù)量787872假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量000假陽(yáng)性率/%000假陰性結(jié)果的數(shù)量000假陰性率/%000LOD和POD驗(yàn)證：通過(guò)協(xié)同實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，樣品濃度在1copy表24絕對(duì)檢測(cè)限的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析牛靶序列拷貝數(shù)（拷貝/PCR反應(yīng)）P/TP(%)P/TP(%)P/TP(%)2078/7878/7872/7278/7878/7872/72578/7878/7872/72269/7888.573/7893.664/7288.9145/7847.750/7864.151/7270.80.527/7834.632/7841.033/7245.80.18/787/789.08/72表25檢出概率（POD）的協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果29參數(shù)牛綿羊?qū)嶒?yàn)室數(shù)量每個(gè)稀釋水平的PCR重復(fù)數(shù)量666實(shí)驗(yàn)室間平均POD0.770,790.82實(shí)驗(yàn)室間平均POD的95%置信區(qū)間0.66-0.860.69-0.880.71-0.90相對(duì)于理想POD曲線（b=1）的斜率b實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差σL0.300.300.30理論中位數(shù)實(shí)驗(yàn)室的LOD95%（以拷貝/PCR反應(yīng)表示）3.23.22024年6月，標(biāo)準(zhǔn)編制小組委托國(guó)家食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心（上海）、四川30表26國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室之間的樣品檢測(cè)結(jié)果比對(duì)（牛成分檢測(cè)方法）Bovine-62bp-F/Bovine-62bp-R/Bovine-62b號(hào)1-++-+-++--+-2-++-+-++--+-3-++-+-++--+-4-++-+-++--+-5-++-+-++--+-6-++-+-++--+-7-++-+-++--+-8-++-+-++--+-9-++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+-結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果結(jié)果為了驗(yàn)證綿羊成分檢測(cè)方法的檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比情況，通過(guò)國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)，向表27國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室之間的樣品檢測(cè)結(jié)果比對(duì)（綿羊成分檢測(cè)方法）Ovine-88bp-F/Ovine-88bp-R/Ovin號(hào)1+-+-++--+--+2+-+-++--+--+3+-+-++--+--+4+-+-++--+--+315+-+-++--+--+6+-+-++--+--+7+-+-++--+--+8+-+-++--+--+9+-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--+為了驗(yàn)證山羊成分檢測(cè)方法的檢測(cè)數(shù)據(jù)對(duì)比情況，通過(guò)國(guó)際協(xié)同實(shí)驗(yàn)，向），表28國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室之間的樣品檢測(cè)結(jié)果比對(duì)（山羊成分檢測(cè)方法）Goat-87bp-F/Goat-87bp-R/Goat-號(hào)1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-5+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-32本項(xiàng)目修改采用ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、ISO/TSfBovineDNAdetectionmethod分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)MolecularbiomarkerfOvineDNAdetectionmethod.分子生物標(biāo)記分析食品和飼料中動(dòng)物源性成分實(shí)Molecularbiomarkfanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsDNAdetectionmethod.分子生物標(biāo)33（2）發(fā)布后、實(shí)施前應(yīng)將信息在媒體上廣為宣傳，建議全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)34[2]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè)定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法:GB/T[3]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法:GB/T[4]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.動(dòng)物源性飼料中反芻動(dòng)物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測(cè)方法PCR方法:[5]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法實(shí)時(shí)PCR法:SN/T[6]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.動(dòng)物產(chǎn)品中牛、山羊和綿羊源性成[9]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其產(chǎn)品成分檢[10]中華人民共和國(guó)工業(yè)和信息化部.肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測(cè)方法PCR法:QB/T[12]中華人民共和國(guó)海關(guān)總署.出口食品及飼料中動(dòng)物源成分快速檢測(cè)方法第7部分:綿羊成分檢測(cè)[16]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法:SN/T2978—2011[S].北京:[17]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.動(dòng)物源性飼料中馬、驢源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法:GB/T[18]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第5部分:馬成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒35[19]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒[21]中華人民共和國(guó)海關(guān)總署.出口食品及飼料中動(dòng)物源成分快速檢測(cè)方法第12部分:火雞成分檢測(cè)[23]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectreal-timePCR—Part1BovineDNAdetectionmethod:ISO[24]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimalderivedmatreal-timeP