2023感染科NGS檢測的意義及解讀

2023感染科NGS檢測的意義及解讀近年來，隨著高通量測序技術(shù)，也稱新一代（或下一代）測序技術(shù)（NGS）的迅猛發(fā)展，在操作流程不斷簡化、檢測通量不斷增長的同時(shí)，檢測成本也大大降低，使其在感染病原體檢測中呈現(xiàn)出一定的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，并得到越來越廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前，基于NGS鑒別微生物的主要方式有兩種：宏基因組測序（mNGS）與病原體靶向測序（tNGS）。病原宏基因組檢測，無需預(yù)設(shè)，無需培養(yǎng)，無偏好性，直接提取臨床樣本中的DNA、RNA，進(jìn)行高通量測序，經(jīng)過專用病原數(shù)據(jù)庫比對(duì)與分析，一次性完成細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體的檢測?；诓≡w核酸序列盲測的mNGS技術(shù)橫空出世，成為感染病診斷的利器。

01指南共識(shí)推薦mNGS經(jīng)歷快速發(fā)展的五年，被引入多部共識(shí)/指南。

最新共識(shí)均推薦mNGS病原學(xué)診斷重要方法，包括《中國宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)檢測感染病原體臨床應(yīng)用專家共識(shí)》、《高通量宏基因組測序技術(shù)檢測病原微生物的臨床應(yīng)用規(guī)范化專家共識(shí)》、《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識(shí)》等。其中《中國宏基因組學(xué)第二代測序技術(shù)檢測感染病原體臨床應(yīng)用專家共識(shí)》推薦mNGS作為新發(fā)、罕見、疑難感染性疾病一線檢測手段。推薦內(nèi)容如下：推薦意見24（強(qiáng)烈推薦，Ⅲ）：對(duì)于呼吸道感染，二代測序在病毒及少見病原體的檢測中體現(xiàn)出較好的檢測效能；但在細(xì)菌、真菌等病原體的檢測中，二代測序尚不能準(zhǔn)確判斷菌群定植或感染狀態(tài)，仍需依賴臨床醫(yī)師結(jié)合患者病情進(jìn)行進(jìn)一步分析。推薦意見26（強(qiáng)烈推薦，Ⅲ）：對(duì)于新發(fā)、罕見、疑難感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代測序能顯著提高病原體的檢出率，可作為上述疾病的一線檢測手段。存在的問題01數(shù)據(jù)量的問題可能存在病原體數(shù)據(jù)量不夠被背景序列淹沒的情況，人源核酸含量越高，mNGS敏感性越低，病原體檢出序列數(shù)越少，甚至導(dǎo)致假陰性。02結(jié)果解讀的痛點(diǎn)閾值設(shè)定、結(jié)果解讀困難，因此亟待解決核心技術(shù)難題，要解決陽性閾值的設(shè)定，排除背景序列的影響，結(jié)合臨床癥狀、流行病學(xué)進(jìn)行解讀。03靈敏度低的難題為解決這一問題，可采取核酸富集技術(shù)，包括反向富集和正向富集，反向富集檢出靈敏度低，背景噪音高。正向富集相對(duì)效果較好，進(jìn)行探針捕獲和多重PCR擴(kuò)增子的比較，發(fā)現(xiàn)探針雜交優(yōu)勢(shì)有Panel覆蓋度高，無偏倚捕獲，具有容錯(cuò)機(jī)制。04影響技術(shù)應(yīng)用效能的關(guān)鍵瓶頸為突破這一瓶頸，可實(shí)施全譜捕獲方案，全譜捕獲超敏mNGS+融合臨床-病原信息的人工智能診斷系統(tǒng)。大數(shù)據(jù)現(xiàn)狀01新冠相關(guān)混合感染常見/特殊細(xì)菌共存相關(guān)數(shù)據(jù)顯示2019年新冠疫情初期有47%的新冠患者存在混合感染。2022年12月11日-2023年2月9日微遠(yuǎn)大數(shù)據(jù)顯示，90%以上新冠陽性樣本有其它病原體共同檢出，涉及細(xì)菌包括鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌等。其中檢出顯著升高的細(xì)菌有：鮑曼不動(dòng)桿菌、屎腸球菌、紋帶棒狀桿菌。02新冠病毒感染者合并鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥1008例鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥株，458例blaOXA-23（45.44%）、344例blaTEM（34.13%）；4405例新冠陽性樣本中，鮑曼blaOXA-23和鮑曼blaTEM檢出率最高，在1.9-1.15日及1.23-1.29日達(dá)峰值。診治病例體會(huì)及思考患者一般情況患者女性，29歲，居住重慶市主城區(qū)，銀行職員。既往史：2022年6月外院診斷HPV感染，規(guī)律我院門診隨訪治療，復(fù)查已轉(zhuǎn)陰。婚育史：未婚未育。病情發(fā)展經(jīng)過（就醫(yī)前病情變化及外院診治、療效）2023.06.18經(jīng)廣州轉(zhuǎn)機(jī)抵達(dá)巴厘島，在巴厘島旅行期間住宿條件較差，被蚊蟲叮咬。2023.06.26上午：發(fā)熱伴頭痛，自服布洛芬，癥狀好轉(zhuǎn)；下午：吃火鍋期間出現(xiàn)發(fā)熱，伴畏寒、寒戰(zhàn)；夜間：出現(xiàn)腹瀉、嘔吐，嘔吐物為胃內(nèi)容物，大便為水樣便，量及次數(shù)較多，仍感發(fā)熱、頭痛，未測體溫。2023.06.27極度乏力，懶言，意識(shí)尚清，可正確對(duì)答，不能自行前往就醫(yī)。后前往重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心診治，患者出現(xiàn)對(duì)答不切題?！镌\斷：膿毒癥、急性胃腸炎（重型）?！镏委煟簛啺放嗄?西司他丁鈉抗感染、退熱等對(duì)癥治療。★治療應(yīng)答：Tmax由40℃降至37.7℃，但易反復(fù)；出現(xiàn)抽搐，呼之不應(yīng)，數(shù)分鐘后緩解，緩解后昏睡，可回答簡單問題，此后抽搐反復(fù)發(fā)作，血壓下降，需血管活性藥物維持血壓。病情發(fā)展經(jīng)過（2023.06.27轉(zhuǎn)入陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院急救部）胸部CT：1.雙肺背側(cè)胸膜下少許墜積性改變；2.雙肺結(jié)節(jié)，考慮炎性或增殖灶可能。腹部CT：1.肝臟增大、密度減低，請(qǐng)結(jié)合臨床分析；2.雙腎實(shí)質(zhì)強(qiáng)化減低；3.盆腔內(nèi)部分小腸腸管積液、稍擴(kuò)張。頭顱CT：顱腦CT平掃未見明顯異常。

★診斷：膿毒癥、膿毒性休克、多器官功能障礙（肝臟、腎臟、心臟、凝血功能）、腹瀉待查?！镏委煟簾o創(chuàng)呼吸機(jī)輔助呼吸、鎮(zhèn)靜、退熱、護(hù)肝、補(bǔ)液、維持電解質(zhì)?！锊∏樽兓悍磸?fù)抽搐，意識(shí)無好轉(zhuǎn)，病情危重。病情發(fā)展經(jīng)過（2023.06.28因病情危重收入ICU）2023.06.28再次腰穿，腦脊液壓力200mmH2O，腦脊液常規(guī)提示單核細(xì)胞比例增高，腦脊液生化提示蛋白明顯增高，考慮病毒性腦炎、腦水腫可能。經(jīng)驗(yàn)性加用阿昔洛韋抗病毒，因腎功能不全，予甘油果糖脫水。患者反復(fù)抽搐，意識(shí)障礙加深，予持續(xù)鎮(zhèn)靜，建立人工氣道，呼吸機(jī)輔助呼吸。2023.06.29腦脊液mNGS結(jié)果提示登革病毒1型（序列數(shù)889）；外周血mNGS陰性。停用阿昔洛韋，予胸腺法新、靜注人免疫球蛋白提高免疫力，抗生素調(diào)整為哌拉西林-他唑巴坦。2023.07.03再次腰穿，腦脊液壓力降至150mmH2O，腦脊液mNGS仍檢測到登革病毒，外周血mNGS陰性。2023.07.04降低鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜劑量，評(píng)估患者意識(shí)為淺昏迷，未再出現(xiàn)明顯抽搐，繼續(xù)鎮(zhèn)靜，調(diào)整呼吸機(jī)模式為CPAP。2023.07.06頭顱CT提示雙側(cè)大腦半球及丘腦密度減低影，雙側(cè)腦室及腦溝回變窄，考慮顱內(nèi)感染性病變?nèi)灾?，GCS評(píng)分5分，考慮患者短期內(nèi)意識(shí)難以恢復(fù)，需長期呼吸機(jī)輔助呼吸，行氣道切開術(shù)，術(shù)后盡早脫離有創(chuàng)呼吸機(jī)。2023.07.07床旁腦電圖提示中度異常，未見明顯癲癇波，CT結(jié)果提示雙肺背側(cè)胸膜下少許墜積性炎癥。2023.07.08痰培養(yǎng)見陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌及銅綠假單胞菌，考慮細(xì)菌定植，呼吸機(jī)順利脫機(jī)。病情發(fā)展經(jīng)過（2023.07.10轉(zhuǎn)入感染病科）2023.07.10患者中度昏迷，間斷四肢抽搐，無尿，夜間出現(xiàn)高熱不退，Tmax40℃，復(fù)查血常規(guī)提示白細(xì)胞明顯增高，PCT明顯升高，拔除深靜脈置管，予美羅培南、萬古霉素抗感染，持續(xù)鎮(zhèn)靜，冰毯冰帽降溫，CRRT血液凈化，病情仍無好轉(zhuǎn)，家屬拒絕轉(zhuǎn)ICU、拒絕CRRT。2023.07.13上午血壓下降，需血管活性藥物維持血壓，復(fù)查床旁胸片（-），WBC39.58×109/L，PCT20.90ng/mL；中午患者心跳呼吸停止，大動(dòng)脈搏動(dòng)消失；下午頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管+血培養(yǎng)：耐碳青霉烯陰溝腸桿菌。死亡診斷：重癥登革熱、登革腦炎、膿毒性休克、血流感染（陰溝腸桿菌）、代謝性酸中毒、肺部感染、多器官功能障礙綜合征、缺血缺氧性腦病、低鈣低鈉高鉀血癥?？偨Y(jié)

感染性疾病起病急、進(jìn)展快，重癥疑難患者病原體復(fù)雜，診斷及治療困難，可危及生命。早期、準(zhǔn)確地明確致病病原微生物對(duì)感染的判定至關(guān)重要，有助于改善預(yù)后。不斷涌