藥敏試驗(yàn)擴(kuò)散法操作方法

關(guān)于藥敏試驗(yàn)擴(kuò)散法操作方法一、概念抗菌藥物敏感性試驗(yàn)（AST，簡稱藥敏試驗(yàn)）：用于測(cè)試抗菌藥物在體外對(duì)病原微生物有無抑制作用。（1）MIC：體外能夠抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，臨床醫(yī)師可以根據(jù)MIC確定藥物劑量。通常達(dá)到穩(wěn)態(tài)的血藥峰濃度（Css）max應(yīng)為MIC的4-8倍，重癥感染以大于8倍為妥。（2）為方便臨床給藥，根據(jù)MIC提供一個(gè)定性的結(jié)果是必要的。臨床醫(yī)師根據(jù)敏感、中介、耐藥的提示結(jié)合MIC可以方便地制定用藥方案。

敏感（S）：表示該藥物對(duì)細(xì)菌的MIC值低于常規(guī)劑量下的抗菌藥物血液濃度或組織濃度4-8倍，可以用常規(guī)劑量治愈。

中介（I）：表示該藥物對(duì)細(xì)菌的MIC值接近于常規(guī)劑量給藥后的血藥濃度或組織藥物濃度，細(xì)菌對(duì)該藥的敏感性降低，但仍可用于生理性濃集部位的感染或使用高劑量藥物進(jìn)行治療（注：必須考慮高劑量的安全性）。

耐藥（R）：表示該藥物對(duì)細(xì)菌的MIC值等于或高于常規(guī)劑量下藥物的血液濃度或組織濃度，細(xì)菌不能被該種藥物抑制。第2頁,共33頁，星期六，2024年，5月意義：1、檢測(cè)病原菌對(duì)各種抗生素的敏感性，指導(dǎo)臨床合理用藥。避免盲目用藥、濫用藥、大劑量用藥。2、監(jiān)測(cè)耐藥性，分析耐藥菌變遷，了解某一地區(qū)致病菌的耐藥變遷、流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)控，控制和預(yù)防耐藥菌株的流行3、為經(jīng)驗(yàn)用藥提供所選藥物的參考依據(jù)，可預(yù)測(cè)抗菌治療的效果?！懊舾小敝委熆赡苡行?；“耐藥”肯定失敗4、新抗菌藥的研究第3頁,共33頁，星期六，2024年，5月以下情況不需進(jìn)行藥敏測(cè)定：標(biāo)本污染細(xì)菌，非致病菌引起已知某些抗菌藥對(duì)某菌有良好的抗菌作用且很少有耐藥菌產(chǎn)生已知細(xì)菌全部耐藥的藥物對(duì)營養(yǎng)要求高而不易生長的細(xì)菌第4頁,共33頁，星期六，2024年，5月二、常用的藥敏測(cè)定方法1、擴(kuò)散法：紙片法、牛津杯法、打孔法等。

紙片法手工測(cè)試的方法，通過測(cè)試藥物紙片在固體培養(yǎng)基上的抑菌圈的大小，判斷細(xì)菌對(duì)該種藥物是否敏感。目前臨床上廣泛使用此法。定性2、稀釋法：瓊脂稀釋法、液體稀釋法（試管、微量）

通過測(cè)試細(xì)菌在含不同濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況，判斷其最低抑菌濃度（MIC）。自動(dòng)化儀器均采用液體稀釋法為藥敏試驗(yàn)的方法。

定量3、E測(cè)定法（Etest）：

與擴(kuò)散法相似，但藥物包被于長塑料條上，能夠精確測(cè)定MIC值。適于一些特殊病原菌的藥敏測(cè)試，但價(jià)格較為昂貴。

4、全自動(dòng)藥敏儀法：第5頁,共33頁，星期六，2024年，5月三、試驗(yàn)準(zhǔn)備及用品藥品（單品藥、藥廠的成品藥、中藥）、恒溫培養(yǎng)箱、藥敏片、培養(yǎng)基、平皿（直徑90mm）、燒杯、蒸餾水、濾紙、打孔器（文具店有售）、0.5麥?zhǔn)媳葷峁芘渲品椒ǎ?/p>

0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2.2H2O)0.5ml0.36NH2SO4(1%,V/V)99.5ml

將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個(gè)月。第6頁,共33頁，星期六，2024年，5月1、培養(yǎng)基MH肉湯（MHB）Mueller-HintonBroth用途：用于抗生素敏感試驗(yàn)配方：（g/L）牛肉粉2.0

可溶性淀粉1.5

酸水解酪蛋白17.5pH值7.4

±

0.2

25℃原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、維生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代謝產(chǎn)物。用法：稱取本品21.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。MH瓊脂（MHA）Mueller-HintonAgar用途：用于抗生素敏感試驗(yàn)配方：（g/L）牛肉粉6.0

可溶性淀粉1.5

酸水解酪蛋白17.5

瓊脂17PH值7.3

±

0.1

25℃原理：牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、維生素和氨基酸；可溶性淀粉吸收有毒的代謝產(chǎn)物；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。用法：稱取本品

42.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,121℃高壓滅菌15分鐘,待冷至

50℃，傾入無菌平皿,備用。1、是兼性厭氧菌和需氧菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基2、如營養(yǎng)要求高可加0.5%羊血。3、平板直徑為9cm。4、瓊脂板厚度4mm。誤差±1mm。5、4℃保存7天。第7頁,共33頁，星期六，2024年，5月營養(yǎng)肉湯（NB）NutrientBroth用途：一般細(xì)菌培養(yǎng),轉(zhuǎn)種,復(fù)壯,增菌等（GB標(biāo)準(zhǔn)）配方：（g/L）蛋白胨10牛肉粉3氯化鈉5pH值7.2

±

0.2

25℃

原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；氯化鈉能維持均衡的滲透壓。用法：稱取本品18.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝三角瓶或管,

121℃高壓滅菌15分鐘備用。營養(yǎng)瓊脂（NA）NutrientAgar用途：一般細(xì)菌培養(yǎng),轉(zhuǎn)種,復(fù)壯,增菌等（GB標(biāo)準(zhǔn)）配方：（g/L）蛋白胨10肉浸粉10氯化鈉5瓊脂20pH值7.2

±

0.2

25℃

原理：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；氯化鈉能維持均衡的滲透壓。用法：稱取本品18.0g,加熱溶解于1000ml蒸餾水中,分裝三角瓶或試管,121℃高壓滅菌15分鐘備用。MH肉湯（￥100）、MH瓊脂（￥250）

；營養(yǎng)肉湯（￥60）

、營養(yǎng)瓊脂（￥80）均可以生化試劑店買到。第8頁,共33頁，星期六，2024年，5月操作步驟：1、玻璃器皿的準(zhǔn)備

沖洗、包裹、滅菌、干燥2、記量、稱取原料3、加熱溶解4、校正PH值5、滅菌6、分裝、包裹、備用第9頁,共33頁，星期六，2024年，5月2、藥敏片1、單藥（一種成分）市場生化試劑店有售，也可自制。但含量及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有嚴(yán)格界定。建議購買2、成藥（復(fù)方成分）多種聯(lián)合的抗菌藥物制劑應(yīng)以其成分中某種含量最高的抗菌藥物為標(biāo)準(zhǔn)稀釋成有效濃度。但多數(shù)廠家由于產(chǎn)品配方機(jī)密，多按產(chǎn)品用量進(jìn)行配制。藥敏片可由廠家提供，也可自制。3、中藥草藥將中藥研成粉未，1克加適量的水充分浸泡煮沸,濾液除去雜質(zhì)后濃縮成1毫升,過濾、高壓滅菌后加入100張紙片干燥備用。制作步驟：1、紙片的準(zhǔn)備2、藥液的配制3、抗菌藥敏紙片制作質(zhì)控：標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑應(yīng)落在預(yù)期范圍內(nèi)，如果超出該范圍，應(yīng)視為失控而予以糾正。第10頁,共33頁，星期六，2024年，5月簡易藥敏片的制法紙片的準(zhǔn)備：1、取新華1號(hào)定性濾紙，用打孔機(jī)打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15-20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。2、藥片吸水量的測(cè)定在上述藥片用微量移液器進(jìn)行滴加蒸餾水，最可使藥片完全浸透又不滴水為宜，最終計(jì)算出每片藥片的吸水量。一般常用直經(jīng)6mm的定性濾紙藥片吸水量為0.01ml。第11頁,共33頁，星期六，2024年，5月藥液的制備（用于商品藥的試驗(yàn)）：按獸藥說明書(或標(biāo)簽)上標(biāo)明的治療量的10-20倍比例配制藥液。如某藥品：100g兌水100kg，表明該藥治療量為1g兌水1L，配制藥液時(shí)就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g藥品，即為配制藥敏片所用的藥液濃度?？咕幍南♂寗┩ǔＳ眉兓Ｕf明：不同廠家標(biāo)示成分及含量相同的成品制劑在用成品做成藥敏時(shí)常出現(xiàn)顯著差異（包括同一廠家生產(chǎn)）由于在進(jìn)行成品制作時(shí)常加入一定量的輔助成份，其對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果常造成較大影響，所以成品藥敏試驗(yàn)結(jié)果并不能完全顯示成品的真實(shí)結(jié)果。不能用單藥的藥敏結(jié)果代替成藥進(jìn)行用藥。（標(biāo)示與真實(shí)成份及含量有很大差別）建議選用廠家提供的以成品主藥成份制作的藥敏片使用。中藥由于其成份復(fù)雜及獨(dú)特作用機(jī)理，藥敏試驗(yàn)不能作為唯一的判定標(biāo)準(zhǔn)。第12頁,共33頁，星期六，2024年，5月抗菌藥敏紙片制作：方法一:

按每張紙片飽和吸水量為0.01毫升計(jì)，在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.5毫升，并翻動(dòng)紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動(dòng)紙片時(shí)不能將紙片搗爛。同時(shí)在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋。方法二：

1、將藥液盛于干凈干燥的平皿中。然后將烘干的紙片逐片放入配制好的藥液中，置于4-8℃浸泡1-2小時(shí)，同時(shí)要注意翻動(dòng)，使各紙片充分透藥液。

2、將浸泡好的藥敏片用鑷子夾出，放入另一干燥平皿中。置于恒溫箱中，溫度37℃，烘干12~24小時(shí)。（注意經(jīng)常翻動(dòng)，避免藥敏片重疊粘連）。

3、將烘干好的藥敏片放入青霉素瓶內(nèi)進(jìn)行保存。第13頁,共33頁，星期六，2024年，5月藥敏紙片的儲(chǔ)存：長期儲(chǔ)存應(yīng)于－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應(yīng)至于含干燥劑的密封容器內(nèi)。使用時(shí)從低溫取出后,放置平衡到室溫后才可打開，用完后應(yīng)立即將紙片放回冰箱內(nèi)的密封容器內(nèi)。過期紙片不能使用,應(yīng)棄去。第14頁,共33頁，星期六，2024年，5月3、高壓滅菌鍋及使用第15頁,共33頁，星期六，2024年，5月4、其他用品第16頁,共33頁，星期六，2024年，5月四、藥敏試驗(yàn)操作步驟：一步法：用病料直接在平板上進(jìn)行涂抹后貼藥敏片，培養(yǎng)后觀察。二步法：先進(jìn)行細(xì)菌的增值培養(yǎng)后，再取培養(yǎng)菌進(jìn)行平板藥敏試驗(yàn)。（紙片法、牛津杯法、打孔法）第17頁,共33頁，星期六，2024年，5月細(xì)菌增值培養(yǎng)：1、剖檢已死亡或即將死亡的家禽。2、以無菌手術(shù)鑷子陸續(xù)取出病料（心，肝，肺，脾均可）。3、在酒精燈上把手術(shù)刀，鑷子，接種環(huán)滅菌，再用接種環(huán)采取病料劃在備好的培養(yǎng)基上，劃線要均勻。（也可用MHB肉湯或營養(yǎng)肉湯上進(jìn)行增菌培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)一般約需6-8h）第18頁,共33頁，星期六，2024年，5月1、紙片瓊脂擴(kuò)散法（1/3）紙片擴(kuò)散法(disk

diffusion

test)，K-B法：

WHO推薦的全球統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法。原理：將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸收瓊脂中水分溶解后不斷向紙片周圍擴(kuò)散形成遞減的梯度濃度,在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)測(cè)試菌的生長被抑制，從而形成無菌生長的透明圈即為抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。第19頁,共33頁，星期六，2024年，5月1、紙片瓊脂擴(kuò)散法（2/3）1、細(xì)菌涂抹平板

在“超凈臺(tái)”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式；用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對(duì)四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點(diǎn)劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細(xì)菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細(xì)菌于少量生理鹽水中制成細(xì)菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密。）2、貼藥片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了使能準(zhǔn)確的觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。第20頁,共33頁，星期六，2024年，5月1、紙片瓊脂擴(kuò)散法（3/3）3、培養(yǎng)觀察將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果第21頁,共33頁，星期六，2024年，5月2、牛津杯法

第一步同“紙片法”細(xì)菌涂抹平板。以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內(nèi)徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙，并在小管處標(biāo)記各種藥物名稱。每個(gè)平板可放4-6支小管。待分鐘后，分別向各小管中滴加一定數(shù)量的各種藥液，勿使其外溢。置37℃培養(yǎng)8-18小時(shí)，觀察結(jié)果。第22頁,共33頁，星期六，2024年，5月3、打孔法：第一步同“紙片法”細(xì)菌涂抹平板。以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（以防藥液滲漏，影響結(jié)果）。加樣：按不同藥液加樣，樣品加至滿而不溢為止。將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察效果。第23頁,共33頁，星期六，2024年，5月五、結(jié)果觀察：在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細(xì)菌生長受到抑制。培養(yǎng)一定時(shí)間后形成一個(gè)抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對(duì)此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細(xì)菌濃度有直接關(guān)系。第24頁,共33頁，星期六，2024年，5月第25頁,共33頁，星期六，2024年，5月聯(lián)合藥敏試驗(yàn)第26頁,共33頁，星期六，2024年，5月抑菌圈邊緣分界清晰、內(nèi)部潔凈透明,說明該抗菌藥物作用迅速,多半為殺菌劑,邊緣不十分清晰、內(nèi)部朦朧說明該抗菌藥物可能是慢效抑菌劑或有耐藥的產(chǎn)生、或分解較快維持抗菌時(shí)間短。抑菌圈中分層次形成同心年輪樣,可能是聯(lián)合使用抗菌藥物或該抗菌藥物失效過快或細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。第27頁,共33頁，星期六，2024年，5月藥物敏感實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)抑菌圈直徑（毫米）敏感度20以上極敏15—20高敏10—14中敏10以下低敏0不敏多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏?？咕胁菟幍呐卸ú煌诳咕魉?通常紙片抑菌直徑達(dá)10毫米以上即視為高度敏感。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，從平板背面測(cè)量最接近的整數(shù)毫米數(shù)并記錄。抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為限。有的菌株可出現(xiàn)蔓延生長，進(jìn)入抑菌環(huán)，磺胺藥在抑菌環(huán)內(nèi)出現(xiàn)輕微生長，這些都不作為抑菌環(huán)的邊緣。結(jié)果判斷依據(jù)鑒定所藥敏紙片判定標(biāo)準(zhǔn)。第28頁,共33頁，星期六，2024年，5月六、影響藥敏結(jié)果的因素藥物因素細(xì)菌因素培養(yǎng)條件培養(yǎng)基藥敏片第29頁,共33頁，星期六，2024年，5月藥物因素藥物的溶解性易溶于水的藥物易擴(kuò)散，難溶性藥物就不易擴(kuò)散藥物的穩(wěn)定性如水解（某些β—內(nèi)酰胺類藥物）、PH值（青霉素鈉遇酸堿分解、紅霉素遇酸不穩(wěn)定）藥物的抗菌機(jī)理殺菌藥物環(huán)邊沿明晰