DB21T 2323-2014 亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)方法

ICS11.220B41DB21DB21/T2323—2014亞洲Ⅰ型口蹄疫病毒RT-PCR檢測(cè)方法MethodofRT-PCRforthedetectionoftypeAsia1footandmouthdiseasevirus遼寧省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布1DB21/T2323—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由遼寧省畜牧獸醫(yī)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、遼寧省動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究院。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：楊本勇、曹東、李井春、王宏燕、李樹博、段亞良、劉坤洋、何利昆、王軍、丁靜、張?chǎng)巍⑼醴?、王海?DB21/T2323—2014本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了亞洲I型口蹄疫病毒（FMDV-AsiaI）RT-PCR檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備、試劑、操作步驟和結(jié)果判定，并介紹了其原理。本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品中亞洲I型口蹄疫病毒的檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范3縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。DEPC（diethypyocarbonate）焦炭酸二乙酯RNA(ribonucleicacid)核糖核酸RT-PCR(reversetranscription-PCR)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)脫氧核苷酸三磷酸bp(basepair)堿基對(duì)O-P液(oesophagus-pharyngeal)牛、羊食道-咽部分泌物EB（Ethidiumbromide）溴化乙錠FMDV-AsiaI（Foot-and-mouthdiseasevirusserotypeAsiaI）亞洲I型口蹄疫病毒4原理FMDV是一種RNA病毒。RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA可作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)FMDV-AsiaI保守基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以引物為延伸起點(diǎn)，通過變性、退火和延伸，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA。5實(shí)驗(yàn)材料、儀器設(shè)備和試劑5.1實(shí)驗(yàn)材料眼科剪、眼科鑷、稱量紙、1.5mL滅菌離心管（經(jīng)DEPC水處理）、0.2mL薄壁PCR管、500mL量筒、500mL三角瓶、吸頭（10μL、200μL、1000μL）。3DB21/T2323—20145.2儀器設(shè)備分析天平、低溫高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、-70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（最大量程分別為2μL、20μL、200μL、1000μL）。5.3試劑5.3.12.5mmol/LdNTP。5.3.2引物：上游引物5′-GCGCTCGTCCACACAGGACCGG-3′,下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3′。5.3.310倍PCR緩沖液。5.3.41%溴化乙錠（EB）溶液（見第A.1）。5.3.5電泳緩沖液（50倍見第A.2）。5.3.61%瓊脂糖凝膠（見第A.3）。5.3.775%乙醇（見第A.4）。5.3.8滅菌DEPC水（見第A.5）。5.3.9上樣緩沖液(見第A.6)。5.3.10電泳緩沖液（1倍見第A.7）。5.3.11磷酸鹽緩沖液（0.04mol/L、pH7.4見第A.8）。5.3.12其他試劑：10U/μLAMV反轉(zhuǎn)錄酶、50U/μLRNA酶抑制劑、5U/μLTaqDNA聚合酶、異丙醇、25mmol/L氯化鎂溶液。注：除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，水為符合GB/T6682-2008的滅菌雙蒸水或超純水。6操作步驟6.1樣品的采集、保存運(yùn)送和處理6.1.1樣品采集6.1.1.1水泡液：未破裂水泡中的水泡液用滅菌注射器吸出后裝入滅菌小瓶中（可加青霉1000UI/mL，鏈霉素1mg/mL），加蓋密封，編號(hào)。6.1.1.2水泡皮：剪取新鮮水泡皮3～5g放入滅菌小瓶中，加6～10mL（2倍體積）50％甘油－磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4),加蓋密封，編號(hào)。6.1.1.3組織樣品：無(wú)菌采集淋巴結(jié)、脊髓等組織樣品3～5g裝入潔凈的小瓶?jī)?nèi)或其他滅菌容器，編4DB21/T2323—20146.1.1.4O-P液樣品：被檢動(dòng)物在采樣前禁食(可飲水)12小時(shí)，以免反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染O-P液。采樣探杯在使用前經(jīng)0.2％檸檬酸或2％氫氧化鈉浸泡5min，再用自來(lái)水沖洗。每采完一頭動(dòng)物,探杯要重復(fù)進(jìn)行消毒和清洗。采樣時(shí)動(dòng)物站立保定，將探杯隨吞咽動(dòng)作送入食道上部10～15cm處，輕輕來(lái)回移動(dòng)2～3次，然后將探杯拉出。如采集的O-P液被反芻胃內(nèi)容物嚴(yán)重污染，要用生理鹽水或自來(lái)水沖洗口腔后重新采樣。將探杯采集到的8～10mLO-P液倒入25mL以上的滅菌玻璃容器中,容器中事先加有8～10mL細(xì)胞培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4)，加蓋密封后充分搖勻，編號(hào)。6.1.2樣品保存與運(yùn)送6.1.2.1樣品保存：采集的樣品冷藏送檢或盡快冷凍保存，避免反復(fù)凍融。6.1.2.2樣品運(yùn)送：樣品裝入保溫壺或保溫桶中加冷凍劑和防震材料，加蓋密封，以最快方式，運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。按照《獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室生物安全技術(shù)管理規(guī)范》進(jìn)行樣品的生物安全標(biāo)識(shí)。6.1.3樣品處理6.1.3.1水皰液：不需處理，可以直接進(jìn)行核酸提取。6.1.3.2水皰皮、組織樣品：取待檢樣品2.0g于潔凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加10mL磷酸鹽緩沖液(0.04mol/L、pH7.4)混勻制成1：5懸液，4℃下3000rpm離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mLEppendorf管中，編號(hào)備用。6.1.3.3O-P液樣品：樣品在混勻器上充分混合后，室溫放置30min，取上清液轉(zhuǎn)入無(wú)菌的1.5mLEppendorf管中，編號(hào)備用。6.1.3.4陽(yáng)性對(duì)照：以滅活的AsiaI型口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)物為陽(yáng)性對(duì)照。6.1.3.5陰性對(duì)照：以滅菌雙蒸水作為陰性對(duì)照。6.2RT－PCR檢測(cè)6.2.1病毒RNA的提取6.2.1.1取n個(gè)新的經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管，其中n為被檢樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照的數(shù)量之和，編號(hào)。6.2.1.2每管加入750μL裂解液，然后分別加入處理過的被檢樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各250μL，顛倒混勻，室溫靜置5min。6.2.1.3每管加入250μL氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15s（或混勻器上振蕩混勻15s室溫放置15min。6.2.1.44℃、12000g離心15min，取上層水相0.5mL于一新的經(jīng)DEPC水處理過的1.5mL滅菌Eppendorf管中，每管加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10min，4℃、12000g離心15min。6.2.1.5小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干，加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇1mL，輕輕旋轉(zhuǎn)洗滌后于4℃、12000g離心10min。6.2.1.6小心棄去上清液，倒置于吸水紙上，沾干液體，不同樣品應(yīng)在吸水紙不同地方沾干，室溫放置或真空干燥5～10min，不能過于干燥，以免降低RNA的溶解度。5DB21/T2323—20146.2.1.7每管加20μLDEPC水和1μLRNA酶抑制劑，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?.2.2RT－PCR擴(kuò)增6.2.2.1RT－PCR反應(yīng)體系組成（總體積25μL）DEPC水2.5mmol/LdNTP10μmol/L上游引物10μmol/L下游引物25mmol/L氯化鎂溶液5倍RT-PCR緩沖液AMV反轉(zhuǎn)錄酶RNA酶抑制劑5U/μLTaqDNA聚合酶提取的RNA6.2.2.2RT－PCR反應(yīng)程序42℃45min，95℃3min；擴(kuò)增條件為94℃伸10min。6.2.3電泳2μL5μL0.5μL0.5μL0.5μL將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6～8μL與1～2μL上樣緩沖液混合，加樣于1%瓊脂糖凝膠孔中，瓊脂糖凝膠板一側(cè)點(diǎn)樣孔加入DL2000MarkDNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物，以5V/cm電壓電泳30min，用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。7結(jié)果判定當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)525bp左右擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照未出現(xiàn)目的帶時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)525bp左右擴(kuò)增帶為AsiaI型口蹄疫病毒陽(yáng)性，未出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增帶的樣品判為陰性。1——DNA2000Marker；2——陽(yáng)性對(duì)照；3——陰性對(duì)照。6DB21/T2323—2014（規(guī)范性附錄） 試劑的配制A.11%溴化乙錠（EB）溶液溴化乙錠0.2g滅菌雙蒸水加至20mLA.2電泳緩沖液（50倍）A.2.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）二水乙二銨四乙酸二鈉（分析純）滅菌雙蒸水80mL氫氧化鈉調(diào)pH至8.0滅菌雙蒸水加至100mLA.2.2TAE(三羥甲基氨基甲烷－乙酸)電泳緩沖液（50倍）羥基甲基氨基甲烷（Tris分析純）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）100mL滅菌雙蒸水加至1000mL用時(shí)用滅菌雙蒸水稀釋使用。A.31%瓊脂糖凝膠瓊脂糖（電泳級(jí)）2gTAE電泳緩沖液4mL滅菌雙蒸水196mL微波爐中完全融化，加溴化乙錠（EB）溶液20μL。A.475%乙醇無(wú)水乙醇（分析純）750mL滅菌DEPC水250mLA.5滅菌DEPC水7DB21/T2323—2014雙蒸水1000mLDEPC1mL用磁力攪拌器室溫下持續(xù)攪拌過夜，分瓶包裝后121℃高壓滅菌25min。A.6上樣緩沖液溴酚藍(lán)0.2g，加雙蒸水10mL過夜溶解，50g蔗糖加入50mL水溶解后，移入已溶解的溴酚藍(lán)溶液中，搖勻定容至100mL。A.7電泳緩沖液（1倍）電泳緩沖液（50倍）10mL滅菌雙蒸水490mLA.8磷酸鹽緩沖液的配制A.8.10.1mol/L磷酸鹽緩沖液氯化鈉（NaCl）80.0g氯化鉀（KC