GB∕T 39729-2020 細胞純度測定要求 流式細胞測定法

ICS07.080CCSC27中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)細胞純度測定通用要求流式細胞測定法GF2020-12-14發(fā)布2021-07-01實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會GB／T39729—2020 1范圍 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語、定義和縮略語 4方法原理 5通用要求 5.1試劑或材料 5.2儀器設(shè)備 5.3樣本制備 5.4試驗步驟 5.5數(shù)據(jù)分析 5.6方法確認(rèn) 參考文獻 ⅠGB／T39729—2020本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心提出并歸口。本文件起草單位：中國計量科學(xué)研究院。ⅡGB／T39729—2020細胞純度是評價和分析細胞樣本特性與細胞產(chǎn)品質(zhì)量的基本參數(shù)，因此醫(yī)學(xué)檢驗、生物醫(yī)藥研發(fā)、生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗等領(lǐng)域需要廣泛開展細胞純度的測量。流式細胞術(shù)可對液體中懸浮單顆粒或細胞進行高速、多參數(shù)分析，是一種常用的細胞純度測量方法。為了實現(xiàn)不同實驗室、平臺、操作人員等測量系統(tǒng)條件之間的數(shù)據(jù)一致性，需要對通過流式細胞術(shù)進行細胞純度試驗的技術(shù)環(huán)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)化。1GB／T39729—2020細胞純度測定通用要求流式細胞測定法本文件描述了流式細胞儀測定細胞純度的術(shù)語、定義和縮略語、方法原理，以及包括試劑或材料、儀器設(shè)備、樣本制備、試驗步驟、數(shù)據(jù)分析、方法確認(rèn)和報告的通用要求。本文件適用于研究、生產(chǎn)與檢驗中通過流式細胞儀進行的細胞純度的測定。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語和定義適用于本文件。與檢測目標(biāo)相一致，具有流式細胞儀可檢測特征（如大小、數(shù)量、特定標(biāo)志物）的細胞。3.1.2目標(biāo)細胞占樣本總細胞數(shù)量的百分率。3.1.3細胞特定成分與熒光染料或標(biāo)記了熒光染料的特異性抗體結(jié)合后進行檢測的一種技術(shù)。注：特定成分為蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。下列縮略語適用于本文件。4方法原理使用流式細胞儀，通過總細胞和目標(biāo)細胞不同的光學(xué)（散射光和熒光）特性，對待測樣本中的總細胞和目標(biāo)細胞進行區(qū)分和計數(shù)。根據(jù)總細胞和目標(biāo)細胞的測量數(shù)量，計算得到目標(biāo)細胞純度。2GB／T39729—20205通用要求選擇的熒光染料應(yīng)能被試驗所用流式細胞儀的激光器激發(fā)，其激發(fā)光信號能被流式細胞儀的檢測器接收。5.1.2熒光染料標(biāo)記的抗體確保選擇的熒光染料標(biāo)記的抗體對目標(biāo)細胞具有特異性。要求。緩沖溶液不應(yīng)造成待測細胞的破裂、形態(tài)嚴(yán)重改變或者聚團，不應(yīng)對待測細胞的光學(xué)特性產(chǎn)生顯著影響，一般為不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液，配制要求和方法應(yīng)根據(jù)具體細胞類型確定。固定劑不應(yīng)造成待測細胞染色后的光學(xué)特性和形態(tài)嚴(yán)重改變。熒光補償樣品為單熒光染色細胞或者熒光補償微球。熒光補償樣品的熒光染料應(yīng)與待測細胞所用的熒光染料一致。熒光補償樣品的熒光強度至少要與待測細胞一致，或者超過待測細胞的熒光強度。具有熒光檢測通道和散射光檢測通道，熒光通道能夠檢測選擇的熒光染料，散射光檢測通道包括流式細胞儀應(yīng)經(jīng)過校準(zhǔn)，并定期核查準(zhǔn)確性和精密度。度和精密度。時長等條件。用于細胞染色的孵育溫度控制或試劑、樣本的保存，例如冰箱。使用者應(yīng)監(jiān)測并記錄溫度控制裝置3GB／T39729—2020的溫度準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。5.3樣本制備根據(jù)原始樣本的類型選擇合適的待測樣本制備方式。待測樣本應(yīng)是單分散細胞懸液，即待測樣本中的細胞以單個細胞存在，沒有細胞團或細胞碎片。運送條件不應(yīng)影響待測細胞的生物特性和檢測結(jié)果。待測樣本應(yīng)具有標(biāo)簽，標(biāo)簽上注明樣本類型、樣本采集和制備的時間和地點。細胞染色前，應(yīng)根據(jù)流式細胞儀的性能參數(shù)、待測細胞的黏附、自然沉降等特性來調(diào)整樣本中的細胞濃度。如果細胞濃度過高，可用緩沖溶液對待測樣本進行稀釋，并記錄稀釋倍數(shù)。根據(jù)熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體質(zhì)量參數(shù)確定樣本量及染料、抗體濃度、孵育條件。保證待測樣本和熒光染料或特異性的熒光染料標(biāo)記抗體充分混合，應(yīng)選擇合適的渦旋轉(zhuǎn)速和時長，轉(zhuǎn)速過高或時間過長會造成細胞破損。待測樣本完成細胞染色后，應(yīng)盡快進行上機檢測。如果無法盡快上機檢測，應(yīng)通過固定劑進行固定5.4試驗步驟應(yīng)根據(jù)流式細胞儀的儀器說明書設(shè)置儀器的工作條件，包括環(huán)境溫度、濕度、電源電壓、大氣壓力、環(huán)境光照等。每次開機后，對流式細胞儀的光路系統(tǒng)進行校驗，可參考流式細胞儀的校驗參數(shù)檢測FSC、SSC和各熒光通道的平均熒光強度、變異系數(shù)和熒光分辨率。5.4.3細胞純度的測量應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照、同型對照、熒光扣除對照，用于識別目標(biāo)細胞并確認(rèn)目標(biāo)細胞的染色方案是否正確。使用不含任何熒光染料的待測細胞樣本作為陰性對照。使用已經(jīng)證明可有效地與待測熒光染料結(jié)合的細胞樣本作為陽性對照。使用與熒光染料標(biāo)記的抗體相同種屬來源、同種免疫球蛋白的相同亞型的相同劑量抗體染色的細胞樣品作為同型對照。使用兩個和兩個以上的熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體組合標(biāo)記細胞樣本時，在完整的染色基礎(chǔ)上4GB／T39729—2020使用減少一種熒光染料或熒光染料標(biāo)記抗體進行細胞染色的待測細胞樣本作為熒光扣除對照。進樣間隔期間，應(yīng)使用清洗液對儀器管道進行清洗。選擇合適的檢測通道后，根據(jù)使用的熒光染料或相關(guān)試劑盒提供的質(zhì)量參數(shù)設(shè)置系列雙參數(shù)散點圖或單參數(shù)直方圖和閾值。照、陽性對照的細胞FSC、SSC信號與細胞碎片或雜質(zhì)分開處于對應(yīng)散點圖中部，見圖1。圖中對應(yīng)熒光通道強度軸閾值的下方，或單參數(shù)直方圖中對應(yīng)熒光強度軸閾值的左方，見圖2。標(biāo)引序號說明：Q1—陰性對照；Q2—陽性對照。圖2流式分析圖譜中陰性／陽性對照的熒光通道信號類群區(qū)分示意圖采用兩種及以上染料組合方案進行細胞計數(shù)時或光學(xué)檢測通道的電壓及增益發(fā)生變動時，應(yīng)進行熒光補償。熒光補償樣品進樣完成后，根據(jù)儀器操作軟件的指示進行手工方式補償或自動補償。5GB／T39729—2020使用同型對照和熒光扣除對照進行對比，通過相應(yīng)散點圖中的熒光強度表達，從陽性對照的熒光信號中區(qū)分出目標(biāo)細胞的陽性信號并進行設(shè)門。應(yīng)在進樣穩(wěn)定后開始采集信號。總細胞信號采集數(shù)量不應(yīng)小于10000，目標(biāo)細胞信號采集數(shù)量不應(yīng)小于1000個。若總細胞信號采集數(shù)量為10000時，不能獲取1000個目標(biāo)細胞采集數(shù)量，可加大總細胞信號采集數(shù)量。信號采集時間應(yīng)保持在合理范圍內(nèi)，過長時間可能導(dǎo)致細胞發(fā)生聚集或沉降。5.5數(shù)據(jù)分析按照公式（1）計算目標(biāo)細胞純度：式中：P—目標(biāo)細胞純度；Nt—總細胞數(shù)量，單位為個。應(yīng)對具體測量方法進行方法性能確認(rèn)。方法性能參數(shù)包括準(zhǔn)確度、精密度、工作范圍（檢出限、線性范圍等）、特異性、方法穩(wěn)健性和組間精密度（如操作者間、儀器間和日間變化）等。可建立評估方法性能參數(shù)的方案和標(biāo)準(zhǔn)，制定并保存相應(yīng)的文件。報告提供的信息應(yīng)至少包括：6GB／T39729—2020