第10章 DNA復(fù)制課件

第十章DNA的生物合成

Chapter10

BiosynthesisofDNADNA是由四種脫氧核糖核苷酸所組成的長鏈大分子，是遺傳信息的攜帶者。生物體的遺傳信息就貯存在DNA的四種脫氧核糖核苷酸的排列順序中。

第10章DNA復(fù)制DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDP中心法則第10章DNA復(fù)制第一節(jié)復(fù)制的基本規(guī)律

一、半保留復(fù)制

DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

半保留復(fù)制的意義在于子代保留了親代的全部的遺傳信息，其體現(xiàn)在于代與代之間DNA堿基序列的一致性上。第10章DNA復(fù)制basepairingduringDNAsynthesisParentalDNAstrandsDaughterDNAstrands第10章DNA復(fù)制

親代DNA

子代DNA

母鏈子鏈

親代DNA的兩條鏈，都作為復(fù)制的模板（母鏈），嚴(yán)格遵從堿基互補(bǔ)原則合成兩條新鏈（子鏈），以構(gòu)成兩個(gè)子代DNA。子代DNA中有一半直接從親代保留下來，只有一半是新合成的。半保留復(fù)制是遺傳的分子基礎(chǔ)。第10章DNA復(fù)制DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代、二代、三代。分別提取DNA，作密度梯度離心，可得到下列結(jié)果：

第10章DNA復(fù)制親代DNA分子第一子代分子第二子代分子15N-DNA14N-DNA混合1

2

3DNA半保留復(fù)制及實(shí)驗(yàn)依據(jù)第10章DNA復(fù)制二、有一定的復(fù)制起始點(diǎn)DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。E.coli復(fù)制起點(diǎn)oriC跨度為245bp第10章DNA復(fù)制三、需要引物

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。

第10章DNA復(fù)制四、雙向復(fù)制

DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。

第10章DNA復(fù)制

DNA從起始點(diǎn)向兩個(gè)方向解鏈，形成兩個(gè)延伸方向相反的復(fù)制叉，稱為雙向復(fù)制。復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制子

第10章DNA復(fù)制五、半不連續(xù)復(fù)制由于DNA聚合酶只能催化底物的5-P加合到延長中子鏈的3-OH上生成磷酸二酯鍵，決定了延長具有方向性。新鏈的生成方向只能從53。即以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。第10章DNA復(fù)制以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?'→3'，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leadingstrand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5'→3'，這條鏈被稱為隨從鏈(laggingstrand)。第10章DNA復(fù)制由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

第10章DNA復(fù)制第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)和拓?fù)鋵W(xué)變化

模板單股DNA母鏈底物dATP，dGTPdCTP，dTTP引物RNA酶及其它輔助因子解旋酶，拓?fù)涿竼捂溄Y(jié)合蛋白引物酶，引發(fā)體聚合酶，連接酶

一.復(fù)制所需的物質(zhì)：第10章DNA復(fù)制二.復(fù)制的化學(xué)反應(yīng)磷酸二酯鍵5`3`dNTP+(dNMP)n

PPi+(dNMP)n+1由DNA聚合酶催化第10章DNA復(fù)制polynucleotidechain3’,5’-phosphodiesterbondii).StructureoftheDNAdoublehelix第10章DNA復(fù)制第10章DNA復(fù)制三、DNA聚合酶

(DDDP,DNA-pol)（一）原核生物的DNA-pol在原核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有三種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），這三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。

第10章DNA復(fù)制

原核生物中的三種DNA聚合酶

第10章DNA復(fù)制(二).真核生物的DNA聚合酶DNA-polα聚合：延長隨從鏈DNA-polβ無其它DNA-pol時(shí)起作用DNA-polγ線粒體內(nèi)，聚合mtDNADNA-polδ聚合：延長領(lǐng)頭鏈DNA-polε校讀，修復(fù)，填補(bǔ)缺口第10章DNA復(fù)制

表：真核生物的DNA聚合酶

DNA聚合酶αβγδε

蛋白質(zhì)分子量（KD）

>25036-38160-300170256細(xì)胞定位核核線粒體核核

5’→3’聚合活性中？高高高3’→5’外切酶無無有有有引物酶有無無無無功能

低保真度的復(fù)制起始引發(fā)，引物酶活性線粒體DNA復(fù)制填補(bǔ)空隙，校讀修復(fù)延長子鏈，解螺旋酶活性第10章DNA復(fù)制(三).DNA復(fù)制的保真性：為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：

1．遵守嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律；

2．DNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對堿基的正確選擇；

3．對復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。

第10章DNA復(fù)制1.DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來。(四).與復(fù)制有關(guān)的其他酶及蛋白因子第10章DNA復(fù)制DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。第10章DNA復(fù)制第10章DNA復(fù)制2、單鏈DNA結(jié)合蛋白單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又稱螺旋反穩(wěn)蛋白（HDP）。這是一些能夠與單鏈DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。其作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

第10章DNA復(fù)制3、解螺旋酶解螺旋酶（unwindingenzyme），又稱解鏈酶或rep蛋白，是用于解開DNA雙鏈的酶蛋白，每解開一對堿基，需消耗兩分子ATP。目前發(fā)現(xiàn)存在至少存在兩種解螺旋酶。DnaB蛋白就是解螺旋酶。DnaA蛋白辨認(rèn)復(fù)制起點(diǎn)，DnaC蛋白起輔助作用。

第10章DNA復(fù)制解旋酶DnaB輔助因子：DnaA：識別復(fù)制起始點(diǎn)DnaC：輔助結(jié)合第10章DNA復(fù)制4、拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ可使DNA雙鏈中的一條鏈切斷，松開雙螺旋后再將DNA鏈連接起來，從而避免出現(xiàn)鏈的纏繞。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ可切斷DNA雙鏈，使DNA的超螺旋松解后，再將其連接起來。大腸桿菌拓樸異構(gòu)酶Ⅰ的結(jié)構(gòu)第10章DNA復(fù)制5．引物酶（primase）

以DNA為模板，聚合NTP（ATP、GTP、UTP、CTP）成RNA引物。引物酶可催化游離NTP的聚合。如此，可提供3’-OH末端，在DNA-pol催化下逐一加入dNTP而延長DNA子鏈。在真核生物，引物酶與DNA聚合酶α形成一個(gè)復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物合成大約10個(gè)核苷酸長的RNA引物第10章DNA復(fù)制第三節(jié)DNA生物合成過程1.復(fù)制的起始DNA解成雙鏈引發(fā)體的生成2.復(fù)制的延長領(lǐng)頭鏈隨從鏈3.復(fù)制的終止原核生物真核生物：端粒和端粒酶第10章DNA復(fù)制一.復(fù)制的起始原核生物只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)

E.colioriC245bp識別區(qū)，AT富含區(qū)真核生物：

有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)(originsofreplication,ori)。復(fù)制起始點(diǎn)有特殊的序列，也含有AT富含區(qū)。第10章DNA復(fù)制1.DNA解成單鏈DnaA識別起始點(diǎn)DnaBDnaC結(jié)合上來解鏈SSB結(jié)合復(fù)制叉形成復(fù)制叉：復(fù)制時(shí)雙鏈打開，分開成兩股，新鏈沿著張開的模板生成，復(fù)制中形成這種Y字形的結(jié)構(gòu)。復(fù)制子：真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，同時(shí)形成許多復(fù)制的單位，兩個(gè)起始點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子。第10章DNA復(fù)制2.形成引發(fā)體并合成引物與起始點(diǎn)相結(jié)合的DnaB、DnaC蛋白，以及引物酶DnaG和DNA起始復(fù)制區(qū)域，共同構(gòu)成引發(fā)體。其中的引物酶催化一段短RNA引物（10-60核苷酸）合成，為復(fù)制的延長階段提供3’-OH末端。原核：DnaB、DnaC、DnaGTopoⅠ，TopoⅡ真核：DNA聚合酶α，DNA聚合酶δ

PCNARFTopoⅠ，TopoⅡ

引發(fā)體的蛋白質(zhì)部分可沿DNA鏈移動(dòng)，以合成RNA引物。領(lǐng)頭鏈一次引發(fā)可連續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制；隨從鏈則須多次引發(fā)進(jìn)行不連續(xù)的復(fù)制。第10章DNA復(fù)制引物酶本質(zhì)上是一種依賴DNA的RNA聚合酶（DDRP），該酶以DNA為模板，聚合一段RNA短鏈引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA鏈能夠開始聚合。

第10章DNA復(fù)制originsofDNAreplication(every~150kb)replicationbubbledaughterchromosomesfusionofbubblesbidirectionalreplicationOriginsofDNAreplicationonmammalianchromosomes5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’5’3’第10章DNA復(fù)制InitiationofDNAsynthesisattheE.coliorigin(ori)5’3’3’5’originDNAsequencebindingofdnaAproteinsAAAdnaAproteinscoalesceDNAmeltinginducedbythednaAproteinsAAAAAAAAAAAABCdnaBanddnaCproteinsbindtothesingle-strandedDNAdnaBfurtherunwindsthehelix第10章DNA復(fù)制AAAAAABCdnaBfurtherunwindsthehelixanddisplacesdnaAproteinsGdnaG(primase)binds...AAAAAABCG...andsynthesizesanRNAprimerRNAprimer第10章DNA復(fù)制BCG5’3’templatestrandRNAprimer(~5nucleotides)PrimasomednaB(helicase)dnaCdnaG(primase)OH3’5’第10章DNA復(fù)制二、復(fù)制的延長

在RNA引物3’-OH基礎(chǔ)上，進(jìn)行DNA鏈5’-3’方向的合成。領(lǐng)導(dǎo)鏈連續(xù)的合成出一條長鏈；隨從鏈則合成許多岡崎片段。

DNA鏈的延長是在DNApol催化，4種dNTP為原料，按照與模板DNA堿基互補(bǔ)的原則（A=T，C≡G），從5’→3’方向逐個(gè)加入dNTP，使DNA鏈得以延長。原核：DNApolⅢ真核：DNApolδ第10章DNA復(fù)制3’5’3’RNAprimernewlysynthesizedDNA5’5’DNApolymerase第10章DNA復(fù)制領(lǐng)頭鏈：順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，稱為~隨從鏈：另一股鏈的復(fù)制方向與解鏈方向相反，它的復(fù)制必須等待模板鏈解開至足夠長度，才能繼續(xù)復(fù)制，因此它的復(fù)制是不連續(xù)復(fù)制，稱為~岡崎片段：不連續(xù)復(fù)制的片斷，大小不等，每個(gè)片段的5`端都帶有一個(gè)引物第10章DNA復(fù)制RNAprimer5’3’3’5’3’5’directionofleadingstrandsynthesisdirectionoflaggingstrandsynthesisreplicationfork第10章DNA復(fù)制5’3’5’3’Movementofthereplicationfork第10章DNA復(fù)制MovementofthereplicationforkRNAprimerOkazakifragmentRNAprimer5’第10章DNA復(fù)制DiscontinuoussynthesisofDNA3’5’5’3’3’5’BecauseDNAisalwayssynthesizedina5’to3’direction,synthesisofoneofthestrands...5’ 3’ ...hastobediscontinuous.Thisisthelaggingstrand.5’3’3’5’5’3’第10章DNA復(fù)制第10章DNA復(fù)制

填補(bǔ)空隙，連接片段，半保留方式生成子代DNA。

RNA酶，DNApolⅠ，DNApolε，DNA連接酶原核：環(huán)狀雙鏈真核：線性結(jié)構(gòu)三、復(fù)制的終止

第10章DNA復(fù)制原核生物RNA酶水解掉引物DNA-polⅠ填補(bǔ)空隙DNA連接酶連接缺口（耗能）真核生物水解引物-填補(bǔ)-連接最前端的引物水解掉后存在一個(gè)空隙端粒端粒酶第10章DNA復(fù)制真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

第10章DNA復(fù)制TelomerestelomereMetaphasechromosomecentromeretelomeretelomerestructureyoungsenescent(TTAGGG)many(TTAGGG)few<1to>12kb第10章DNA復(fù)制端粒酶（telomerase）是催化端粒合成的酶。端粒酶是由蛋白質(zhì)及RNA組成的，它具有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，能與自身攜帶的RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA

第10章DNA復(fù)制

端粒DNA：人的DNA的3’末端存在的重復(fù)順序（TTAGGG）n

端粒酶：催化端粒DNA的復(fù)制，酶本身含有與端粒DNA序列互補(bǔ)的RNA片段。第10章DNA復(fù)制端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制第10章DNA復(fù)制第10章DNA復(fù)制第四節(jié)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄是RNA病毒復(fù)制的形式。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)包括以RNA為模板合成DNA，雜化雙鏈RNA水解和以單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA三步反應(yīng)。該三步反應(yīng)的催化是由逆轉(zhuǎn)錄酶來完成的。在基因工程操作中，可用逆轉(zhuǎn)錄酶來制備cDNA。第10章DNA復(fù)制RNA模板RNADNADNA雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶病毒細(xì)胞內(nèi)第10章DNA復(fù)制RNADNADNA雙鏈DNA（cDNA）逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow片段堿水解mRNA模板實(shí)驗(yàn)室第10章DNA復(fù)制第五節(jié)DNA的損傷與修復(fù)

一、DNA的損傷（突變）

由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DNA的損傷，也稱為突變（mutation）。突變是進(jìn)化的分子基礎(chǔ).常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。

第10章DNA復(fù)制（一）引起突變的因素：1．自發(fā)因素：

(1)自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬個(gè)核苷酸殘基。

(2)自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個(gè)核苷酸殘基。

(3)復(fù)制錯(cuò)配：由于復(fù)制時(shí)堿基配對錯(cuò)誤引起的損傷，發(fā)生頻率較低。

第10章DNA復(fù)制2．物理因素：由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價(jià)鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會(huì)引起復(fù)制障礙。

第10章DNA復(fù)制3．化學(xué)因素：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。

第10章DNA復(fù)制（二）DNA突變的類型：

第10章DNA復(fù)制（三）DNA突變的效應(yīng)：

1．同義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA密碼子第三位堿基的改變但不引起密碼子意義的改變，其翻譯產(chǎn)物中的氨基酸殘基順序不變，但有時(shí)可引起翻譯效率降低。

2．誤義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA密碼子堿基被置換，其意義發(fā)生改變，翻譯產(chǎn)物中的氨基酸殘基順序發(fā)生改變。

3．無義突變：基因突變導(dǎo)致mRNA密碼子堿基被置換而改變成終止密碼子，引起多肽鏈合成的終止。

4．移碼突變：基因突變導(dǎo)致