菌種操作規(guī)程

關(guān)于菌種操作規(guī)程1目的建立菌種操作規(guī)程，確保菌種保藏、自然選育、生產(chǎn)供種操作規(guī)范性，提供優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的生產(chǎn)菌種。2范圍生產(chǎn)一部菌種組。3責任菌種組操作人員負責本操作規(guī)程的實施。第2頁,共37頁，星期六，2024年，5月安瓿管的制備

空白安瓿管的制備安瓿管有三種：手榴彈形、球形、直形。任意選取一種放于重鉻酸鉀-濃硫酸溶液（100g/mL）中浸泡10h，然后取出用自來水反復沖洗多次，最后用蒸餾水洗二次，烘干。將寫有菌種編號及制備膜的標簽放入安瓿管內(nèi)，將有字的一面向管壁，塞上棉塞，121℃滅菌1小時。第3頁,共37頁，星期六，2024年，5月脫脂牛奶的制備將買來的新鮮牛奶倒入離心管中以3000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去掉上層的脂，下層即為脫脂牛奶。脫脂好的牛奶倒入試管（Φ18×200mm）或250mL三角瓶中，置消毒鍋中滅菌，滅菌溫度110℃、時間20分鐘。按10%的抽樣率抽取滅菌好的脫脂牛奶作無菌實驗，每支肉湯倒入約1mL左右的牛奶。然后置37℃恒溫間培養(yǎng)48h觀察肉湯變化情況，判定是否染菌，如無染菌，即可使用。第4頁,共37頁，星期六，2024年，5月孢子懸浮液的制備將經(jīng)過搖瓶考察指標符合要求對照的斜面孢子，制成高濃度的孢子懸浮液，用無菌的毛細吸管或注射器將菌液分裝于安瓿管底部，每管裝0.3～0.5mL第5頁,共37頁，星期六，2024年，5月預凍及速凍灌裝好的安瓿管置2～5℃冰箱預凍1h，然后置-30℃溫度下速凍1h后取出，置真空干燥器內(nèi)。第6頁,共37頁，星期六，2024年，5月真空干燥將裝在安瓿管的真空干燥器接入真空泵上，在-15℃溫度下，抽真空6～8h。然后再在室溫抽4h。第7頁,共37頁，星期六，2024年，5月封口將抽好的安瓿管在酒精噴燈上進行熔封（邊抽真空邊封口）。安瓿管的泄漏測定用高頻火花測定儀進行測定。測定方法：將測定儀照著安瓿管管壁打一槍，如果各壁呈紫色的光即為合格，如果沒有顏色，呈白光，即是不合格產(chǎn)品。保藏合格安瓿管置2～5℃冰箱保藏，保藏期為1～10年。記錄安瓿管在保藏過程中應(yīng)控制溫度，每天查看溫度并填寫《溫度、濕度原始記錄》，在使用過程中應(yīng)填寫《安瓿管使用記錄》。第8頁,共37頁，星期六，2024年，5月砂土管的制備

砂的處理普通黃沙用稀酸（1N的HCL或H2SO4）或稀堿（1NNaOH）浸泡12小時后,倒去酸水，用自來水充分沖洗至PH中性，烘干后用磁鐵吸去鐵屑，經(jīng)60目篩過篩后備用。土的處理取離地面1公尺以下的黃土，（不含有機質(zhì)）打碎，加適量水充分攪拌，將上層混濁液倒出靜置（下層成塊的土棄之）使土沉淀，倒出上層清液后，再加適量水攪拌，沉淀。如此反復洗滌直到PH呈中性。沉淀出來的土烘干，碾碎，經(jīng)80目篩過濾后備用第9頁,共37頁，星期六，2024年，5月砂土管的制備方法將處理好的沙和土按2：1(或其它比例)混合均勻，分裝于10mm×100mm硬質(zhì)玻璃試管中，每支砂土管裝量為1.5克，用新做的棉塞塞好，并外包牛皮紙，123～125℃濕熱滅菌30min，間歇滅菌6次，每隔24小時一次，最后一次消好后置135～145℃烘箱干烘一小時，然后進行抽樣無菌檢查，每10支砂管抽1支，將沙土倒入肉湯培養(yǎng)基中，36～38℃培養(yǎng)48小時，若仍有雜菌，則需要全部重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌，方可備用。第10頁,共37頁，星期六，2024年，5月砂土孢子的制備斜面孢子的選擇及質(zhì)量標準取經(jīng)選育的單菌落制備的大試管斜面孢子或生產(chǎn)良好的茄氏瓶斜面孢子，具以下條件：孢子層生長豐滿，較均勻，孢子數(shù)量較多，少水，孢子呈淡黃色。斜面孢子一般培養(yǎng)7～9天，孢子成熟。經(jīng)無菌試驗檢查正常。發(fā)酵搖瓶試驗生產(chǎn)能力符合要求。生產(chǎn)能力試驗：原則上每批斜面孢子應(yīng)作生產(chǎn)能力試驗，尤其在大生產(chǎn)不正常情況下，為配合發(fā)酵工藝尋找異常原因，每批斜面應(yīng)作搖瓶考察。

7-9天11天斜面孢子搖瓶發(fā)酵放瓶指標要求：DW≥（對照）94%；TL≥（對照）94%；AA≥45%，指標符合要求，方可使用，并填寫《搖瓶考察配制記錄》和《原材料搖瓶考察》。第11頁,共37頁，星期六，2024年，5月生產(chǎn)斜面的制備

生產(chǎn)斜面分為子斜面和母斜面，其PDA培養(yǎng)基配方如下：成分馬鈴薯葡萄糖瓊脂KH2PO4MgSO4配比20%2%2%0.05%0.025%規(guī)格自然分析純生物試劑分析純分析純第12頁,共37頁，星期六，2024年，5月生產(chǎn)斜面

選擇無芽馬鈴薯去皮后用蒸餾水洗干凈，稱量所需重量，并切成邊長0.5厘米左右的方形。將馬鈴薯碎塊放在鋁鍋內(nèi)，加入一定量的蒸餾水，置于電爐上煮沸30分鐘，邊煮邊攪拌，防止馬鈴薯結(jié)底。用雙層紗布濾出馬鈴薯原液，然后按照配方將稱量好的葡萄糖加入溶解，再用吸管吸取KH2PO4、MgSO4溶液加入，用量筒定容至所需體積，PH自然。將定容后的培養(yǎng)液放置電爐上加熱，將稱量好的瓊脂，邊攪拌邊加入，待瓊脂全部融化后，取下培養(yǎng)基進行分裝。母斜面用30×200mm的大試管分裝，每支大試管約20mL；子斜面用茄子瓶分裝，每支約60mL，裝好后，塞好棉塞，用雙層紗布扎口后，再用牛皮紙扎口，放置在不銹鋼筐中，蓋上牛皮紙，準備消毒。將準備好的不銹鋼筐放在消毒車上推入消毒柜內(nèi)，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保溫30分鐘，接種用具保溫60分鐘。消毒結(jié)束后，取出斜面待溫度降至40～50℃時，將大試管或茄子瓶擺成斜面，空白斜面培養(yǎng)1～2天，觀察無雜菌生長后，包裝好備用，并填寫《PDA斜面配制記錄》和《培養(yǎng)基接種用具消毒記錄》。第13頁,共37頁，星期六，2024年，5月母斜面接種及培養(yǎng)母斜面接種由兩人操作，一人為主操作安瓿管，一人為輔操作大試管。首先用消毒好的砂輪在安瓿管上端1/4處劃痕，用紗布包住，掰開上端。用毛細吸管吸取0.5mL左右的無菌蒸餾水加入安瓿管中，攪拌均勻，然后吸取0.1～0.2mL接入大試管斜面中，每支安瓿管接3支大試管。用無菌鏟將種液在斜面上劃線，使之均勻分布，然后塞上棉塞，用雙層紗布扎口，并將接種鏟在肉湯培養(yǎng)基中蘸一下做無菌試驗，將肉湯放置37℃培養(yǎng)間培養(yǎng)。將接種后的母斜面放置培養(yǎng)間，溫度28℃，濕度50～70%，培養(yǎng)7～9天，觀察生長情況，并填寫《母斜面生長記錄》和《溫度濕度原始記錄》。母斜面生長成熟后，取下，無菌試驗正常則用0.1%新潔而滅溶液滅菌后再用牛皮紙扎口后放置冰箱低溫保藏備用溫度2～8℃，保藏期不超過15天；無菌試驗不正常則按廢樣液處理辦法處理并填寫《廢樣液處理記錄》。第14頁,共37頁，星期六，2024年，5月子斜面接種及培養(yǎng)子斜面接種由兩人操作，一人為主操作，一人為輔操作。首先將子斜面和母斜面的雙層紗布解去，將繩子和紗布放在超凈臺左邊待用。主操作將母斜面和子斜面的棉塞逐個打開，并在酒精燈火焰上燒瓶口至無水霧為止。主操作用無菌鏟將母斜面上的孢子和菌絲刮下，接種于子斜面中，利用子斜面的冷凝水，將孢子和菌絲打散，均勻涂布于子斜面表面，然后塞上棉塞，用雙層紗布扎口，并將接種鏟在肉湯培養(yǎng)基中蘸一下做無菌試驗，將肉湯放置36～38℃培養(yǎng)間培養(yǎng)。一支母斜面接種一般接1～2支子斜面。將接種后的子斜面放置培養(yǎng)間，溫度28℃，濕度50～70%，培養(yǎng)7～9天，觀察生長情況，并填寫《子斜面生長記錄》和《溫度濕度原始記錄》。子斜面生長成熟后，取下，無菌試驗正常則用0.1%新潔而滅溶液滅菌后再用牛皮紙扎口后放置冰箱低溫保藏備用，保藏期不超過15天；無菌試驗不正常則按廢樣液處理辦法處理并填寫《廢樣液處理記錄》。第15頁,共37頁，星期六，2024年，5月母瓶菌絲的制備

母瓶培養(yǎng)基配方成份葡萄糖酵母粉PH配比3%1.5%8.2～8.8規(guī)格分析純符合酵母粉驗收標準第16頁,共37頁，星期六，2024年，5月

配制稱量時，一般將不溶或難溶物質(zhì)（如酵母粉等）和易溶解物分開稱，根據(jù)母瓶培養(yǎng)基配方稱取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用蒸餾水溶解，酵母粉直接按配比分裝于三角瓶內(nèi)。定容后用10N的NaOH調(diào)節(jié)PH至8.2～8.8，按每瓶100mL的量分裝于500mL直口三角瓶內(nèi)，塞好棉塞，用雙層紗布扎口后，再用牛皮紙扎口，放置在不銹鋼筐中，蓋上牛皮紙，準備消毒。將準備好的不銹鋼筐放在消毒車上推入消毒柜內(nèi)，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保溫30分鐘，接種用具保溫60分鐘并填寫《母瓶配制記錄》和《培養(yǎng)基接種用具消毒記錄》。第17頁,共37頁，星期六，2024年，5月母瓶接種及培養(yǎng)

母瓶接種由兩人操作，一人為主操作子斜面，一人為輔操作母瓶，主操作用接種鏟取孢子于茄氏瓶中，一支鏟子只能用于一只子斜面，將3～5支子斜面的孢子接入裝有80mL無菌水的帶玻璃珠三角瓶中，放置搖床上180～220轉(zhuǎn)/分鐘搖10～15分鐘制成孢懸液。用10mL吸管吸取5mL孢懸液接種于母瓶，接種后塞上棉塞，包扎紗布，置180～220轉(zhuǎn)/分搖床上，28±1℃培養(yǎng)44～50小時左右，待菌絲長好后取下，準備并瓶。并瓶前應(yīng)按5%的比例對母瓶進行抽查，觀察菌絲的外觀，測定菌濃和PH，并進行鏡檢，合格后才可并瓶。母瓶進罐前，要在無菌條件下并瓶，一般情況下10～12瓶合并為一個種瓶，約1000～200mL。種瓶并好后，將瓶口包扎紗布和牛皮紙，等待進罐，若母瓶不進罐，并瓶后應(yīng)置于2～8℃冰箱保存，期限不超過2天。并瓶后，每五個三角瓶殘液并為一瓶，接種于肉湯培養(yǎng)基中做無菌試驗；在接種小罐后將種瓶中的殘液接種于肉湯培養(yǎng)基中做無菌試驗，將肉湯培養(yǎng)基放置36～38℃培養(yǎng)間培養(yǎng)，觀察變化情況，作為一種無菌監(jiān)測，為事后分析作準備。在發(fā)酵水平出現(xiàn)連續(xù)異常時，應(yīng)對母瓶搖瓶進行跟蹤實驗。第18頁,共37頁，星期六，2024年，5月母瓶菌絲質(zhì)量標準

外觀淺黃色至棕黃色、刺球狀或花狀。菌濃不小于25%。菌絲階段

Ⅱ～Ⅲ階段。PH5.5～7.0。鏡檢沒有污染雜菌。第19頁,共37頁，星期六，2024年，5月小罐接種操作

本工藝采用菌絲進罐和傾倒式接種法。接到消毒人員通知后接種。首先準備好無菌石棉手套、白工作服和帽，再準備好工業(yè)酒精、火焰圈和打火機。接種人員穿好衣服后，一人將浸泡工業(yè)酒精的火焰圈套在小罐接種口上，一人拆開種瓶包扎的牛皮紙和紗布，待消毒人員通知后點燃火焰圈，燃燒一分鐘左右，當接種帽旋下后，在火焰圈內(nèi)迅速打開種瓶棉塞，將種液傾倒入小罐內(nèi)，殘余種液在超凈臺接種肉湯培養(yǎng)基，作無菌監(jiān)測，接種完畢后填寫《種瓶生產(chǎn)進罐記錄》和《培養(yǎng)基接種用具消毒記錄》。第20頁,共37頁，星期六，2024年，5月?lián)u瓶試驗

發(fā)酵搖瓶配方

發(fā)酵搖瓶配制

發(fā)酵搖瓶接種操作

第21頁,共37頁，星期六，2024年，5月發(fā)酵搖瓶配方

成分葡萄糖酵母粉PH配比8%2%8.2～8.8規(guī)格符合驗收標準符合驗收標準第22頁,共37頁，星期六，2024年，5月發(fā)酵搖瓶配制

稱量時，一般將不溶或難溶物質(zhì)（如酵母粉等）和易溶解物分開稱，根據(jù)發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基配方稱取所需葡萄糖和酵母粉重量，葡萄糖用自來水溶解，酵母粉直接按配比分裝于三角瓶內(nèi)。定容后用10N的NaOH調(diào)節(jié)PH至8.2～8.8，按每瓶100mL的量分裝于500mL翻口三角瓶內(nèi)，塞好專用夾心紗布，用牛皮紙扎口，放置在不銹鋼筐中，蓋上牛皮紙，準備消毒。將準備好的不銹鋼筐放在消毒車上推入消毒柜內(nèi)，按蒸汽消毒柜使用方法用蒸汽消毒，119～121℃，保溫30分鐘，接種用具保溫60分鐘并填寫《搖瓶配制記錄》和《培養(yǎng)基接種用具消毒記錄》。第23頁,共37頁，星期六，2024年，5月發(fā)酵搖瓶接種操作

發(fā)酵搖瓶接種由兩人操作，一人為主操作子斜面，一人為輔操作搖瓶，主操作用接種鏟取孢子于茄氏瓶中，一支鏟子只能用于一只子斜面，將3～5支子斜面的孢子接入裝有80mL無菌水的帶玻璃珠三角瓶中，放置搖床上搖10～15分鐘制成接種后將搖瓶瓶口紗布扯平扎緊，置180～220轉(zhuǎn)/分搖床上，28℃±1℃濕度50%～70%的條件培養(yǎng)11天后，下?lián)u瓶測生物量、總油和AA的含量并填寫《原材料搖瓶考察結(jié)果記錄》。第24頁,共37頁，星期六，2024年，5月菌種選育和復壯

自然分離

初篩、復篩

第25頁,共37頁，星期六，2024年，5月自然分離

每年進行一次。先將菌株作分離培養(yǎng)，挑出若干個單孢子菌落，將這些菌落初篩和復試，選出比出發(fā)菌株高產(chǎn)的優(yōu)良菌株

孢子懸浮液制備：取斜面孢子于適量的有玻璃珠的無菌水的三角瓶中，放置小搖床上，時間一般為15分鐘即可。分離培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）。在滅菌好的培養(yǎng)皿內(nèi)，加入約15mL滅菌好的馬鈴薯培養(yǎng)基，置水平凝固后，一支1mL無菌吸管從孢子懸浮液中吸取1mL注入盛有9mL無菌水的試管中，吹吸三次，使充分混和，然后用一支1mL無菌吸管從此試管中吸取1mL注入另一盛有9mL無菌水的試管中，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各種稀釋度的孢子懸浮液（注：稀釋液最好提前準備，空白培養(yǎng)1～2天為好）。將上述各種稀釋度的溶液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的順序，用無菌的涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻。將其放于28℃±1℃，溫度50%～70%的恒溫間培養(yǎng)48小時左右，待菌落長好后挑出若干個單孢子菌落接于斜面上，待斜面長好后，要進行搖瓶考察，初篩結(jié)果好的斜面用于生產(chǎn)埋砂土管，若初篩不好，需復篩，直到選出比出發(fā)菌株高產(chǎn)的菌株第26頁,共37頁，星期六，2024年，5月初篩、復篩

由單孢子菌落接種的斜面孢子→搖瓶發(fā)酵→下?lián)u瓶測試DW、TL、AA、（以母株作對照）→選出較高菌落將其斜面埋砂土→復篩（每株用三個搖瓶、重復三次）→最后選出比出發(fā)菌株高的菌株作生產(chǎn)菌種，或是選出一個較高的新變種作進一步選育之用。第27頁,共37頁，星期六，2024年，5月廢液樣處理方法

菌種廢母瓶、廢懸浮液，化驗樣余樣，菌種觀察菌絲及測PH多余發(fā)酵液等均不得直接倒入下水道，必須升溫至100℃左右煮沸30分鐘后，再放入下水道并填寫《廢樣液處理記錄》。第28頁,共37頁，星期六，2024年，5月染色劑的配制

美蘭（亞甲苯基蘭，一種堿性染料）取0.3克美蘭溶于30mL95%酒精中，再加蒸餾水至100mL過濾即得。酚紅配制方法一：稱取1克酚紅于研缽中，用0.05N氫氧化鈉調(diào)成糊狀，研磨，再分次加入氫氧化鈉溶液（總量為57mL）研磨，充分溶解后，加蒸餾水至100mL，過濾即成。方法二：稱取1克酚紅于研缽中，用43mL的95%的酒精溶解后，再次加入總量為57mL的0.05N氫氧化鈉，待其充分溶解后，過濾即成。碳酸品紅染色劑堿性品紅酒精飽和液：品紅1克、溶于9mL95%酒精

5%石碳酸溶液：石碳酸4.5克，溶于90mL蒸餾水中兩種溶液混合，攪勻，過濾即得。第29頁,共37頁，星期六，2024年，5月消毒劑配制

1.5～2.0%來蘇爾溶液：150～200mL來蘇爾加蒸餾水至10000mL。75%酒精：95%酒精79mL加蒸餾水至100mL。甲醛熏煙：40%甲醛50mL，高錳酸鉀20克盛于牛皮紙中包好，帶入無菌室混合，緊閉無菌室經(jīng)1～2天后，借送風設(shè)備將甲醛—高錳酸鉀氣體排出。丙二醇50mL加熱熏煙滅菌。0.1%新潔爾滅菌溶液：1mL新潔爾溶液加蒸餾水至1000mL。1%～2%來蘇爾溶液：將10%的來蘇爾溶液稀釋5～10倍。重鉻酸鉀—濃硫酸（100g/mL）（洗液）配制：稱取化學純重鉻酸鉀100g于燒杯中，加入100mL蒸餾水，微加熱，使其溶解。把燒杯放于水盆中冷卻后，慢慢加入化學純硫酸，邊加邊用玻璃棒攪拌，防止硫酸濺出，開始有沉淀析出，硫酸加到一定量沉淀可溶解，加硫酸至溶液總體積為1000mL第30頁,共37頁，星期六，2024年，5月細菌培養(yǎng)基

肉湯培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基第31頁,共37頁，星期六，2024年，5月肉湯培養(yǎng)基配制配方成分葡萄糖牛肉膏氯化鈉蛋白胨酚紅配比0.5%1%0.5%0.5%0.4%規(guī)格分析純生物試劑分析純生物試劑分析純第32頁,共37頁，星期六，2024年，5月配制為了稱量方便，一般稱牛肉膏時放玻璃棒，其它成分分別加適量的蒸餾水溶解之，混合后加足水量，再加酚紅溶液，攪拌均勻，用10N的氫氧化鈉調(diào)PH到7.00～7.40。分裝將配制好的肉湯培養(yǎng)基分裝于18×180mL試管中，裝量每支約為8mL，塞棉塞，裝入有牛皮紙的不銹鋼筐中。消毒在0.1MPa蒸汽壓力，119℃～121℃下滅菌30分鐘，滅菌后置36～38℃恒溫室培養(yǎng)24小時后檢查無雜菌生長，溶液清亮無沉淀，消后PH為7.0左右，每批使用期不超過7天，《肉湯培養(yǎng)基配制記錄》和《培養(yǎng)基接種用具消毒記錄》。第33頁,共37頁，星期六，2024年，5月固體培養(yǎng)基配制

配方成分蛋白胨牛肉膏酵母膏氯化鈉葡萄糖瓊脂配比1%1%0.3%0.5%1.5%2%規(guī)格生物