T-CVMA 162-2024 非洲豬瘟病毒LAMP目視檢測(cè)方法

T/CVMA162—2024Visualloop-mediatedisothermalamplificationassayfordetectionofAfricanswinefevervirus2024-5-23發(fā)布2024-5-23實(shí)施中國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布I本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及條目6豬瘟病毒的引物組、熒光可視化快速檢測(cè)試劑盒及方法》相關(guān)專(zhuān)12規(guī)范性引用文件NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范DNA：脫氧核糖核酸（DeoxyriboNucleicAcid）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）26.1.4.10.01mol/L磷酸鹽緩沖液的配制，6.1.4.2病毒DNA提取試劑盒、Bst2.0D6.2.2PCR管：0.2mL，7.1高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)：離心速度可達(dá)120007.2冰箱：2℃~8℃、-20℃以下及-70℃冰箱。7.3金屬浴或等效控溫設(shè)備：25℃~100℃。3——豬全血、血清等液體樣品，可直接取1mL加入離心管中，60℃條件下滅活30min后，編號(hào)備mol/L磷酸鹽緩沖液，制成組織勻漿，4℃條件下8000r/min離心5min，取上清液編號(hào)備用；——口鼻拭子、環(huán)境拭子類(lèi)樣品，將裝有口鼻拭子、環(huán)境拭子類(lèi)樣品的離心管，直接60℃條件下——飼料樣品，取5g，放入裝有鋼珠的離心管中，加入800μL的0.01mol/L磷勻漿器中充分研磨后，60℃條件下滅活30min，4℃條件下8000r/min離心5min，取上清液編號(hào)備用。采集或處理的樣品在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h；若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，避在樣本制備區(qū)內(nèi)，按照商品化的病毒DNA提取試劑盒操作說(shuō)明8.5.2在樣品制備區(qū)額完成加樣，向8.5.1步驟編號(hào)的PCR核酸、陽(yáng)性對(duì)照2μL，蓋緊管蓋，振蕩混勻后，瞬時(shí)離8.5.3在擴(kuò)增區(qū)，將PCR反應(yīng)管放入金屬浴或等效控溫設(shè)備，設(shè)置溫度63℃,時(shí)間55min。試驗(yàn)結(jié)9結(jié)果判定45非洲豬瘟病毒B646L基因（VP72）序列（Pig/HLJ/2018株，GenBa6注1：序列來(lái)自GenBank中公布的非洲豬瘟病毒Pig/HLJ7FIP溶液（100μmol/L）BIP溶液（100μmol/L）LB溶液（100μmol/L）DEPC處理水B.20.01mol/L磷酸鹽緩沖B.2.10.2mol/L磷酸二B.2.20.2mol/L磷酸氫B.2.30.01mol/L磷酸鹽緩沖液（8陽(yáng)性對(duì)照制備方法：人工合成非洲豬瘟病毒VP72基因片段，序列參見(jiàn)附錄A，將VP72基因克隆到pUC57載體上，獲