TGXAS-海水 類固醇激素的測定的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法編制說明

PAGEPAGE1《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（征求意見稿）編制說明《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制組二〇二三年十二月項(xiàng)目名稱：海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法項(xiàng)目統(tǒng)一編號：2022-4802本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站、廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、上海第二工業(yè)大學(xué)、廣東海洋大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：任朝興、藍(lán)文陸、韋業(yè)、高桂蘭、龍慧琴、王其春、吳鑫、房琴、蘇子幸、張文武、王永峰、廖麗、趙利容、張鵬、張際標(biāo)、黃仕英、吳茂銀。PAGE12PAGE16目錄1任務(wù)來源 12標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和意義 12.1類固醇激素的分類、來源及危害 12.2本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息 22.2現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施情況和存在問題 53國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究 53.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究 53.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究 54標(biāo)準(zhǔn)編制工作過程 64.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組 64.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料 74.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則 84.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿 84.5方法驗(yàn)證工作 84.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明 85標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線 85.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則 85.2標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍和主要技術(shù)內(nèi)容 85.3標(biāo)準(zhǔn)制修訂的技術(shù)路線 86方法研究報告 106.1方法研究的目標(biāo) 106.2方法原理 106.3試劑和材料 106.4儀器的選擇 106.5樣品 106.6分析步驟 116.7結(jié)果計(jì)算與表示 197方法驗(yàn)證 217.1方法驗(yàn)證方案 217.2方法驗(yàn)證過程 227.3方法驗(yàn)證結(jié)論 228重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù) 229自我承諾 22參考文獻(xiàn) 23附件一方法驗(yàn)證報告 27《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制說明1任務(wù)來源根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達(dá)2022年第四十六批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目計(jì)劃的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2022〕99號）文件精神，由廣西環(huán)境科學(xué)學(xué)會提出，廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站、廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、上海第二工業(yè)大學(xué)、廣東海洋大學(xué)、廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心共同起草的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（項(xiàng)目編號：2022-4802）。2標(biāo)準(zhǔn)制定的必要性和意義2.1類固醇激素的分類、來源及危害類固醇激素是一類由膽固醇合成代謝具有生物活性的化合物。根據(jù)其生物學(xué)功能可以分為性激素和腎上腺皮質(zhì)激素。性激素主要包括雌激素、雄激素和孕激素，腎上腺皮質(zhì)激素包括糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素，許多類固醇激素藥物已經(jīng)廣泛用于人類和動物的治療。人工合成的糖皮質(zhì)激素如地塞米松、強(qiáng)的松、強(qiáng)的松龍等廣泛用于治療各種炎癥包括關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、哮喘、支氣管炎、皮疹、過敏、鼻子和眼睛的炎癥。人工合成的孕激素如炔諾酮，炔諾孕酮等用于避孕治療、子宮異常出血、更年期癥狀和某些癌癥治療。人工合成的雄激素如康力龍，甲睪酮，群勃龍等不僅用于臨床治療，還在養(yǎng)殖業(yè)尤其是肉牛養(yǎng)殖中作為雄性促生長劑的使用以及用于提高運(yùn)動員成績的促進(jìn)劑。環(huán)境中的類固醇激素主要來自于人和動物的排泄物如尿液和糞便以及人工合成的類固醇激素的使用和排放。經(jīng)過人和動物排泄過程，類固醇激素會通過污水處理廠出水口或者人為直接排放進(jìn)入到環(huán)境中。類固醇激素是內(nèi)分泌干擾物的一種，由于其在極低的濃度下（ng/L）的水平就可能對生物體的生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，導(dǎo)致生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)失衡，因而備受公眾和科學(xué)界的廣泛關(guān)注。前人對于環(huán)境中類固醇激素進(jìn)行了大量研究，在地表水、污水處理廠、水產(chǎn)養(yǎng)殖場、畜禽養(yǎng)殖場、污泥、土壤ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>馬帥</Author><Year>2015</Year><RecNum>4182</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>4182</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="aez99x0a89af5feafavxszpq0rtfz5zdpsfa">4182</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>馬帥</author><author>韓平</author><author>馮曉元</author></authors></contributors><auth-address>北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心,農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(北京);</auth-address><titles><title>土壤環(huán)境中類固醇激素的來源、環(huán)境行為及檢測研究</title><secondary-title>農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全</secondary-title></titles><periodical><full-title>農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全</full-title></periodical><pages>41-46+62</pages><number>03</number><keywords><keyword>土壤</keyword><keyword>類固醇激素</keyword><keyword>來源</keyword><keyword>環(huán)境行為</keyword><keyword>檢驗(yàn)檢測</keyword></keywords><dates><year>2015</year></dates><isbn>1674-8255</isbn><call-num>11-5896/S</call-num><urls></urls><remote-database-provider>Cnki</remote-database-provider></record></Cite></EndNote>[和生物體中均有檢出。Zhang等利用建模的方法估算7種類固醇激素在中國流域的排放量，并預(yù)測它們在環(huán)境中的歸趨，發(fā)現(xiàn)類固醇激素每年總排泄量中人體排泄物占38%，動物排泄物占62%，每年經(jīng)過處理進(jìn)入環(huán)境的類固醇激素排放量是2486噸，大約有83%的類固醇激素進(jìn)入水體環(huán)境。海洋是地球水域集中地，人類生產(chǎn)和使用的大部分類固醇激素會通過入海污染源途徑進(jìn)入海洋環(huán)境。近年來，海洋環(huán)境中類固醇激素也越來越受到學(xué)者的重視，部分學(xué)者對愛爾蘭都柏林灣、南海海陵灣、南海流沙灣、廣東大亞灣等和廣西北海灣等研究了類固醇激素污染分布特征及生態(tài)風(fēng)險評價。其中在南海海陵灣區(qū)域類固醇激素的檢出濃度范圍為0.04～40ng·L-1，風(fēng)險系數(shù)等級依次從污水排放場到碼頭、養(yǎng)殖區(qū)、旅游區(qū)再到近海地區(qū)降低。2.2本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息如下表2-1。表2-1本標(biāo)準(zhǔn)研究的目標(biāo)化合物的基本信息化合物英文名稱CAS號分子量分子式結(jié)構(gòu)式理化性質(zhì)諾龍Nondrolone434-22-0274.398C18H26O2結(jié)晶固體，熔點(diǎn)：120-125oC雄烯二酮Androstensdione63-05-8286.41C19H26O2熔點(diǎn)：170-173oC表睪酮EpiTestosterone481-30-1288.42C19H28O2白色或奶油色白色結(jié)晶粉末，熔點(diǎn)：218-220oC甲睪酮17-Methyltestosterone58-18-4302.451C20H30O2白色結(jié)晶性粉末，無臭，無味，溶于乙醇、甲醇、乙醚和其他大多數(shù)有機(jī)溶劑，微溶于植物油，幾乎不溶于水，熔點(diǎn)：162-168oC炔諾酮Norethindrone68-22-4298.42C20H26O2白色結(jié)晶粉末，不溶于水，微溶于乙醇，略溶于丙酮，溶于氯仿，熔點(diǎn)：205-206oC孕酮(黃體酮)Progesterone57-83-0314.46C21H30O2白色結(jié)晶性粉末，無臭，溶于醇、丙酮和二氧六環(huán)，微溶于植物油，不溶于水，熔點(diǎn)：128-132oC甲地孕酮Megestrol3562-63-8342.47C22H30O3白色或微黃色結(jié)晶性粉末，無臭。在空氣中穩(wěn)定。熔點(diǎn)202～209℃，極易溶于氯仿，溶于丙酮，略溶于乙酸乙酯，微溶于無水乙醇，不溶于水甲羥孕酮Medroxyprogesterone520-85-4344.5C22H32O3白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭。不溶于水，易溶于氯仿，微溶于無水乙醇。熔點(diǎn)202～208℃可的松Cortisone53-06-5360.44C21H28O5白色結(jié)晶性粉末，溶于乙醇、丙酮和冷甲醇，極少溶于乙醚、苯和氯仿，微溶于水，水溶液呈中性。在濃硫酸中呈深紅色溶液，并有深綠色熒光。熔點(diǎn)：223-228oC氫化可的松（皮質(zhì)醇）Hydrocortisone50-23-7362.46C21H30O5白色或類白色結(jié)晶性粉末，不溶于水，難溶于乙醚，微溶于氯仿，溶于丙酮、乙醇地塞米松Dexamethason50-02-2392.46C22H29FO5白色或類白色結(jié)晶性粉末，無臭，甲醇、乙醇、丙酮或二氧六環(huán)中略溶，在三氯甲烷中微溶，在乙醚中極微溶解，在水中幾乎不溶，熔點(diǎn)：255-264oC雌酮(雌酚酮)Estrone53-16-7270.37C18H22O2白色板狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末幾乎不溶于水，溶于\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"二氧六環(huán)、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"吡啶和氫氧化堿溶液，微溶于乙醇(1：400)、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"丙酮、苯、\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"氯仿、乙醚和\t"/item/%E9%9B%8C%E9%85%AE/_blank"植物油。17-α雌二醇17alpha-Estradiol57-91-0272.38C18H24O2粉末，溶于乙醇、丙酮及堿性水溶液，略微溶于乙醚及氯仿，不溶于水及稀酸。熔點(diǎn)：176-180oC17β-雌二醇(雌二醇)

17β-Estradiolum50-28-2272.38C18H24O2白色或乳白色無臭結(jié)晶性粉末；無臭。在\t"/item/17%CE%B2-%E9%9B%8C%E4%BA%8C%E9%86%87/_blank"二氧六環(huán)、丙酮及其他有機(jī)溶劑溶解，在乙醇中略溶，不溶于水。雌三醇Estriol50-27-1288.38C18H24O3白色結(jié)晶粉末，難溶于水，微溶于乙醇(1：500)、乙醚、氯仿、二氧六環(huán)和植物油，易溶于吡啶和氫氧化堿溶液。熔點(diǎn)：280-282oC17a-乙炔雌二醇(炔雌醇)17A-ethinylestradiol4717-40-2296.40C20H24O2無色針狀晶體，幾乎不溶于水，能溶乙醇、乙醚、丙酮、氯仿、二嗯烷2.2現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施情況和存在問題2.2.1現(xiàn)行污染物分析方法標(biāo)準(zhǔn)的局限性國內(nèi)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)中針對海水中類固醇激素的測定目前仍是空白，國外美國EPA1694利用HPLC-MS/MS技術(shù)，采用同位素標(biāo)識物為內(nèi)標(biāo)物定量測定環(huán)境樣品中的藥物及個人護(hù)理用品，適用于廢水、地表水、地下水、固廢不同環(huán)境基體，但也僅是分析抗生素。2.2.2污染物分析儀器、設(shè)備、方法等的最新進(jìn)展環(huán)境中類固醇激素的分析方法主要有：免疫分析法(Immunoassay)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC－MS)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC－MS)和氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(GC－MS/MS)。免疫分析法對于具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)的激素時，傳統(tǒng)的免疫法的選擇性不高，導(dǎo)致準(zhǔn)確率降低和交叉反應(yīng)，除此之外還有靈敏度低、低通量等的缺陷而使其使用受限。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀具有高靈敏度、選擇性好、能效高等優(yōu)點(diǎn)解決了傳統(tǒng)免疫法的問題，但是類固醇激素目標(biāo)物揮發(fā)性差，使得樣品在分析前需要復(fù)雜的衍生化處理，使實(shí)驗(yàn)步驟變得繁瑣復(fù)雜也增加了實(shí)驗(yàn)操作時間。液質(zhì)聯(lián)用法(LC－MS)、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC－MS/MS)無需衍生化處理，不僅具有氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀的優(yōu)點(diǎn)，也簡化了前處理技術(shù)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，超高液相色譜技術(shù)和三重四級桿質(zhì)譜技術(shù)大大的提高了儀器的靈敏度、同時滿足準(zhǔn)確定性?直接進(jìn)樣?快速檢測等要求。3國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究3.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究經(jīng)查閱有相關(guān)科研文獻(xiàn)中涉及到水質(zhì)中類固醇激素的測定方法。Sara等采用SPE-LC-ESI-MS/MS同時檢測河水及污水中的雌激素，該方法前處理時間僅需要1h，檢測限在0.02～1.02ng/L之間，回收率在74%之上。馬有寧等建立了超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定雌性斑馬魚性腺中13種類固醇激素的分析方法，平均加標(biāo)回收率為74.8%～127.0%。周永順等利用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定沉積物中24種CSs的分析方法，24種CSs的平均回收率為64.9％～125.1％，并測定3份珠江三角洲河流沉積物，檢出11種目標(biāo)物，含量范圍為1.25～29.38μg/kg。孫?琳建立了固相萃?。咝б合嗌V－質(zhì)譜聯(lián)用法對雌三醇、氟哌噻噸、炔雌醇、雄烯二酮、雌二醇、雌酚酮、睪酮共7種類固醇激素的檢測方法方法的檢出限為0.66～1.95ng/L，R＞0.998，回收率為78.5%～94.6%。3.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究關(guān)于類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，已有地方水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)廣東僅測試雌激素，山東測試的為環(huán)境激素，目前國內(nèi)還沒有測定海水中的這類藥物方法，但在化妝品、動物源性食品中的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法較多，見表3-1。表3-1化妝品、動物源食品中類固醇激素的標(biāo)準(zhǔn)方法方法出處方法號目標(biāo)化合物前處理分析方法檢出限適用范圍中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T21981-2008雄烯二酮、甲睪酮、雌酮、雌二醇、雌三醇、甲羥孕酮、孕酮、可的松、氫化可的松等超聲提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.4～2.0μg/kg豬肉、牛奶等動物源食品中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T22957-2008糖皮質(zhì)激素溶劑提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.2～1.0μg/kg河豚魚、鰻魚、烤鰻中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T34918-2017性激素溶劑提取→SPE柱凈化超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.156mg/kg化妝品中國檢驗(yàn)檢疫總局GB/T40154-2021糖皮質(zhì)激素超聲提取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.03μg/g化妝品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T1980-2007孕激素超聲提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法1.0～2.0μg/kg動物源性食品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T2222-2008糖皮質(zhì)激素培養(yǎng)-提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.75～10μg/kg動物源性食品中國檢驗(yàn)檢疫總局SN/T2677-2010雄性激素提取→SPE柱凈化高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法0.001～0.01mg/kg動物源性食品農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部1031號公告-2-2008糖皮質(zhì)激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\動物源性食品農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部1063號公告-5-2008糖皮質(zhì)激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\飼料農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)部282號公告-1-2020雌激素提取→SPE柱凈化液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法\飼料山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/74158-2020環(huán)境激素固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.2～0.8ng/L水質(zhì)廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB44/T2016-2017雌激素固相萃取液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法0.6～0.9ng/L水質(zhì)4標(biāo)準(zhǔn)編制工作過程4.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，立即成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，制定標(biāo)準(zhǔn)編寫方案，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。為高質(zhì)量編制團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》，對標(biāo)準(zhǔn)編制工作組進(jìn)行分工，見表4-1。表4-1標(biāo)準(zhǔn)編制小組分工主要起草人(單位)承擔(dān)的工作任朝興（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)項(xiàng)目申請立項(xiàng)、整體構(gòu)思、編制思路及整體定位、項(xiàng)目技術(shù)把控及項(xiàng)目的整體組織和推進(jìn)等。任朝興（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）藍(lán)文陸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）張際標(biāo)（廣東海洋大學(xué)）對標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行撰寫與修改；按專家提出的意見修改標(biāo)準(zhǔn)文本；匯總和撰寫編制說明，匯總征求意見，撰寫標(biāo)準(zhǔn)解讀、上報函等技術(shù)資料，協(xié)調(diào)有關(guān)單位方法驗(yàn)證工作。韋業(yè)（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）王其春（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）房琴（上海第二工業(yè)大學(xué)）張鵬（廣東海洋大學(xué)）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制工作：包括實(shí)驗(yàn)方案以及方法文本、研制報告、編制說明的撰寫并征集意見等工作。龍慧琴（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）賀亮（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）房琴（上海第二工業(yè)大學(xué)）吳鑫（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）蘇子幸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）張文武（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）負(fù)責(zé)采樣、分析工作、監(jiān)測結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)。王永峰（廣西壯族自治區(qū)欽州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）黃仕英（廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）廖麗（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）趙利榮（廣東海洋大學(xué)）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的驗(yàn)證工作：包括驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、驗(yàn)證報告的撰寫及校核工作。藍(lán)文陸（廣西壯族自治區(qū)海洋環(huán)境監(jiān)測中心站）高桂蘭（上海第二工業(yè)大學(xué)）吳茂銀（廣西藍(lán)合創(chuàng)訊數(shù)據(jù)科技有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)文本的校核工作：包括標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明的校核工作。4.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制小組根據(jù)國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)修訂工作管理辦法的相關(guān)規(guī)定，檢索、查詢和收集國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料，了解掌握測定分析方法的國內(nèi)外最新技術(shù)發(fā)展情況，對現(xiàn)有各種方法和監(jiān)測工作需求開展調(diào)查研究。通過調(diào)研了解到目前國外尚無水中類固醇激素的限值標(biāo)準(zhǔn)。對于標(biāo)準(zhǔn)分析方法，美國環(huán)保署（EPA）頒布了采用高分辨氣相色譜/高分辨質(zhì)譜分析水、土壤、沉積物和生物體中的類固醇和激素（EPAmethed1698）。該方法利用GC-MS/MS技術(shù)，采用同位素標(biāo)識物為內(nèi)標(biāo)物定量測定環(huán)境樣品中類固醇激素。國內(nèi)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)體系中針對海水中類固醇激素的測定目前仍是空白，但有針對動物源食品、化妝品中此類藥物的分析方法標(biāo)準(zhǔn)。4.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則2022年6月，編寫項(xiàng)目任務(wù)計(jì)劃，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容、原則、技術(shù)路線等內(nèi)容，明確了海水水中的類固醇激素成分為本標(biāo)準(zhǔn)的分析對象。采用固相萃取預(yù)處理技術(shù)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用分析方法，提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度。4.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿2023年6月，本標(biāo)準(zhǔn)編制組經(jīng)過大量文獻(xiàn)調(diào)研和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定海水中類固醇激素的方法，編制完成了《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》標(biāo)準(zhǔn)方法文本。4.5方法驗(yàn)證工作2023年6月-12月，組織了6家有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，在收回了全部的驗(yàn)證報告基礎(chǔ)上，進(jìn)行了數(shù)據(jù)的匯總和分析整理工作，并編寫完成了《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》驗(yàn)證匯總報告。4.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明2023年9月，編寫《海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》的標(biāo)準(zhǔn)文本征求意見稿及編制說明，并對文本和編制說明進(jìn)行修改。5標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線5.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則1）方法的檢出限和測定范圍滿足相關(guān)環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)保工作的要求。2）方法準(zhǔn)確可靠，滿足各項(xiàng)方法特性指標(biāo)的要求。3）方法具有普遍適用性，易于推廣使用。5.2標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍和主要技術(shù)內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)適用于海水中類固醇激素的測定。使用固相萃取技術(shù)，選擇不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，對物質(zhì)中的目標(biāo)成分進(jìn)行選擇性萃取，利用LC-MS/MS進(jìn)行測定，獲得滿意的回收率，并驗(yàn)證固相萃取技術(shù)作為樣品前處理技術(shù)的可行性。5.3標(biāo)準(zhǔn)制修訂的技術(shù)路線海水類固醇激素的測定海水類固醇激素的測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法選擇6家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)方法適用性研究實(shí)際樣品測試建立類固醇激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法樣品前處理方法研究選擇6家具有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)方法適用性研究實(shí)際樣品測試建立類固醇激素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法樣品前處理方法研究樣品采集、運(yùn)輸與保存儀器分析與方法研究樣品采集、運(yùn)輸與保存儀器分析與方法研究質(zhì)量控制與質(zhì)量保證技術(shù)研究參照文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)際試驗(yàn)情況，確定采樣與保存技術(shù)建立液相色譜分離方法，考察色譜柱類型、梯度洗脫優(yōu)化等條件考察固相萃取參數(shù)：質(zhì)量控制與質(zhì)量保證技術(shù)研究參照文獻(xiàn)、標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)際試驗(yàn)情況，確定采樣與保存技術(shù)建立液相色譜分離方法，考察色譜柱類型、梯度洗脫優(yōu)化等條件考察固相萃取參數(shù)：上樣體積和速度、小柱填料、淋洗液種類和流速、洗脫液種類和流速流量等建立質(zhì)譜分析方法，選擇母離子和相應(yīng)子離子，優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能等重要參數(shù)。建立質(zhì)譜分析方法，選擇母離子和相應(yīng)子離子，優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能等重要參數(shù)?？闪炕笜?biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)、平行樣品的相對偏差、實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率、方法檢出限等可量化指標(biāo)包括：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)、平行樣品的相對偏差、實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率、方法檢出限等6方法研究報告6.1方法研究的目標(biāo)建立適用于海水中類固醇激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。6.2方法原理采用固相萃取樣品前處理方法，用高效液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）檢測海水中的類固醇激素化合物，按多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式，根據(jù)保留時間和特征離子峰定性，內(nèi)標(biāo)法定量。6.3試劑和材料6.3.1實(shí)驗(yàn)用水為一級水。6.3.2試劑為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜純化學(xué)試劑，在使用前均進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)，滿足方法要求才可使用。6.3.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等均為購置市售有證標(biāo)準(zhǔn)品。6.3.4本方法使用市售商品化固相萃取柱HLB柱，填料為親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物，通用于非極性到極性化合物。6.4儀器的選擇本標(biāo)準(zhǔn)制定組通過調(diào)研國內(nèi)外文獻(xiàn)及試驗(yàn)摸索，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定類固醇激素，既免去了繁瑣的衍生化前處理過程，只需萃取富集，又具備較高的靈敏度。6.5樣品6.5.1采樣器皿的洗滌對所有與樣品直接接觸的器皿，均應(yīng)采取措施保證其潔凈度，避免造成污染或干擾。6.5.2采樣步驟樣品采集參照《海洋監(jiān)測規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸》（GB17378.3-2007和《近岸海域環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范第三部分近岸海域水質(zhì)監(jiān)測》（HJ442.3-2020）的相關(guān)規(guī)定，制定樣品采集方法及質(zhì)控措施，用預(yù)先洗滌干凈并烘干的螺口棕色玻璃瓶采集水樣。水樣采滿瓶。6.5.3樣品的保存采集的樣品應(yīng)盡快分析，確需保存時，應(yīng)在4℃以下避光保存，7d內(nèi)完成前處理。6.5.4流速的選擇對于大體積環(huán)境水樣中有機(jī)物的富集，上樣最大流速不應(yīng)超過5ml/min，因此我們選擇5ml/min作為上樣流速。6.5.5固相萃取條件選擇不同固相萃取柱的比較由于類固醇激素化合物具有親酯性，而HLB柱填料為親水親酯型聚合物，C18柱填料是鍵合硅膠材料，C18柱和HLB柱均具有較好的穩(wěn)定性，均能用于環(huán)境內(nèi)分泌污染物的檢測。但C18柱的pH耐受范圍為2-8，而HLB柱的pH耐受范圍為1-14，海水樣品的pH范圍多為6-9。再者C18柱具有疏水性質(zhì)，而HLB柱具有親水性質(zhì)，所以在使用過程中如果出現(xiàn)小柱干涸的情況，C18柱會影響回收率，而HLB柱不會。通過空白加標(biāo)回收率結(jié)果，C18柱對雄烯二酮和炔諾酮的吸附效果不如HLB柱好，綜上，本實(shí)驗(yàn)室選取HLB柱。淋洗液的種類淋洗要洗掉固定相內(nèi)不需要的樣品組分，所以淋洗液要略強(qiáng)于或等于上樣溶劑，淋洗液多為水。實(shí)驗(yàn)采用10%甲醇-水淋洗時，目標(biāo)化合物已有少量損失，故實(shí)驗(yàn)采用純水作為淋洗液。洗脫液的選擇實(shí)驗(yàn)還考察了甲醇和乙酸乙酯的配比對目標(biāo)化合物回收率水平的影響。結(jié)果表明，甲醇和乙酸乙酯作為洗脫液配比為1:1時，回收率最高。最終選擇甲酸-乙酸乙酯溶液（1:1）作為洗脫液。6.6分析步驟本方法擬采用固相萃取法處理水樣，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水中目標(biāo)物。方法包括樣品采集、樣品提取、凈化、儀器分析、數(shù)據(jù)處理和質(zhì)量管理等方面的內(nèi)容。6.6.1液相色譜條件甲酸可以增加氫離子濃度，促進(jìn)[M+H]+分子離子峰的形成，提高離子化效率和靈敏度，同時也會抑制離子化效率。當(dāng)水相中添加了甲酸后，各組分的色譜峰形變窄，色譜峰形對稱，目標(biāo)化合物的色譜峰峰形明顯改善，響應(yīng)更強(qiáng)，根據(jù)廠商多年實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，加酸濃度為0.1%。同時我們還對流動相梯度洗脫程序進(jìn)行了優(yōu)化，由于雄烯二酮和炔諾酮的保留時間一致，未能使它們的色譜峰達(dá)到完全分離，其他組分均能達(dá)到基線分離。考慮到我們使用的是質(zhì)譜檢測器，采用的是多離子反應(yīng)監(jiān)測模式，對未達(dá)到基本分離的目標(biāo)化合物也能進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析，不影響分析結(jié)果。6.6.2質(zhì)譜條件優(yōu)化采用電噴霧電離源（ESI）在正離子模式下對雄激素、孕激素和糖皮質(zhì)激素化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，均有較好的響應(yīng)。選定[M+H]+為母離子，進(jìn)行選擇性離子掃描（SIM），以確定源內(nèi)碎裂電壓，再進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，以不同的碰撞能量將待測物的準(zhǔn)分子離子打碎，尋找子離子碎片。采用MRM模式，以子離子響應(yīng)最強(qiáng)時的參數(shù)來確定碰撞能量，表1為目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件。表6-1類固醇激素的多離子反應(yīng)監(jiān)測條件化合物名稱母離子m/z子離子m/z駐留時間s錐孔電壓V碰撞能eV雄激素諾龍（Nondrolone）275.2109.1*4.723525257.33510雄烯二酮

（Androstensdione）287.396.84.754024108.9*4023表睪酮

（Epitestosterone）289.496.9*5.303525108.93527睪酮-D3

（Testosterone-D3）292.397.0*4.923020109.03025甲睪酮

（17-Methyltestosterone）303.297.25.203323109.2*3323孕激素5炔諾酮

（Norethindrone）299.2109.1*4.793827231.13820炔諾酮-d6（替代物）

（Norethindrone-d6）305.3113.0*4.763525237.03517孕酮(黃體酮)

（Progesterone）315.297.1*5.612823297.12816孕酮(黃體酮)-D9

（Progesterone-D9）324.4100.2*5.582820113.12820甲地孕酮

（Megetrol）343.397.0*5.282525224.02525甲羥孕酮

（Medroxyprogesterone）345.297.1*5.452626123.22624糖皮質(zhì)激素可的松（Cortisone）359.2121.03.953027163.1*3025氫化可的松（皮質(zhì)醇）（Hydrocortisone）363.2309.24.113014327.2*3015氫化可的松-1,2-d2（Cortisone-1,2-d2）365.1311.24.093014329.2*3014地塞米松

（Dexamethason）393.2355.2*4.453010373.23011雌激素雌酮（Estrone）269.2142.94.023048144.9*303617-α雌二醇（17-alpha-Estradiol）271.2144.9*4.143040239.2303917β-雌二醇（17-beat-Estradiol）271.1144．9*4.003040182.93036雌三醇（Estriol）287.2145.03.183039171.0*3037雌三醇-D3（Estriol-D3）290.2147.0*3.172540173.02531注：帶*的為定量離子，對于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。注：帶*的為定量離子，對于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。6.6.3標(biāo)準(zhǔn)曲線配制質(zhì)量濃度分別為0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20μg/、50μg/L和100μg/L的類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列（此為參考濃度）。在該濃度范圍內(nèi)各組分的相關(guān)系數(shù)均大于0.995。圖6-1類固醇激素總離子流色譜圖6.6.4方法檢出限按照《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ168-2020）的相關(guān)規(guī)定，連續(xù)分析7個接近于檢出限濃度（5ng/L）的實(shí)驗(yàn)室空白加標(biāo)樣品，計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差S。用公式:MDL=S×t(n-l,0.99)，（t（6,0.99）=3.143）進(jìn)行計(jì)算。其中：t(n-l,0.99)為置信度為99%、自由度為n-1時的t值；n為重復(fù)分析的樣品數(shù)。測定下限為4倍檢出限。經(jīng)全過程分析，數(shù)據(jù)結(jié)果見表6-2。表6-2方法檢出限計(jì)算結(jié)果（取樣體積1000mL，n=7）化合物測定值（ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ng/L)檢出限(ng/L)測定下限(ng/L)1234567諾龍11.35.2雄烯二酮81.87.2表睪酮2.02.00.421.45.6甲睪酮1.22.02.02.01.90.441.45.6炔諾酮52.710.8孕酮61.56.0甲地孕酮3.53.00.652.18.4甲羥孕酮2.43.00.411.35.2可的松3.64.00.280.93.6氫化可的松2.83.00.953.012.0地塞米松62.18.4雌酮4.35.00.311.04.017-α雌二醇31.45.617β-雌二醇91.04.0雌三醇4.03.90.321.04.06.6.5方法的精密度對三個濃度水平分別為低濃度（10ng/L）、中濃度（20ng/L）、高濃度（50ng/L）類固醇激素加標(biāo)水樣進(jìn)行了精密度測試（見表6-3到表6-5），每個濃度水平配制6份平行樣品。從表中可以看出，低中高濃度測試的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.2%～14.4%、2.7%～14.7%、2.9%～14.5%，說明方法的精密度良好。表6-3低濃度樣品測試的精密度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ng/L)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍雄烯二酮9.310.410.9表睪酮甲睪酮炔諾酮孕酮甲地孕酮8.710.98.2甲羥孕酮可的松氫化可的松8.27.08.5地塞米松6.90.710.1雌酮8.71.011.517-α雌二醇9.09.59.09.57.79.717β-雌二醇雌三醇表6-4中濃度樣品測試的精密度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ng/L)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍13.413.516.513.315.214.3雄烯二酮19.121.419.821.319.75.0表睪酮19.119.819.718.017.78.2甲睪酮17.817.017.616.315.716.5炔諾酮18.615.915.8孕酮19.018.518.618.017.718.7甲地孕酮19.517.420.018.01.79.4甲羥孕酮17.617.421.416.717.115.717.62.011.4可的松17.914.816.5氫化可的松17.214.717.917.01.16.3地塞米松20.322.716.420.516.122.619.72.914.7雌酮16.117.917.517.516.94.117-α雌二醇16.216.617.714.317.514.317β-雌二醇14.117.717.215.815.114.8雌三醇14.516.216.316.214.916.7表6-5高濃度樣品測試的精密度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)偏差(ng/L)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)123456諾龍31.931.635.936.836.033.6雄烯二酮54.551.350.555.355.357.254.02.64.8表睪酮50.359.448.658.566.045.054.67.914.5甲睪酮39.442.030.3炔諾酮45.840.844.750.650.451.3孕酮51.047.147.055.049.151.050.03.06.0甲地孕酮35.136.735.738.033.236.8甲羥孕酮42.932.934.431.033.630.434.24.513.2可的松44.341.642.347.846.647.545.02.76.0氫化可的松42.738.936.343.942.339.7地塞米松34.232.733.735.533.434.734.01.02.9雌酮49.042.236.436.442.243.741.64.811.517-α雌二醇40.342.235.544.544.140.517β-雌二醇50.246.043.847.440.843.5雌三醇32.135.432.136.036.5方法的正確度對三個濃度水平分別為低濃度（10ng/L）、中濃度（20ng/L）、高濃度（50ng/L）類固醇激素加標(biāo)水樣進(jìn)行了正確度測試（見表6-6到表6-8），每個濃度水平配制6份平行樣品。從表中可以看出，低中高三種不同濃度的加標(biāo)水樣，加標(biāo)回收率范圍分別為71.0%～114%、73.0%～114%、66.6%～118%，說明方法的正確度良好。表6-6低濃度樣品測試的正確度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)值(ng/L)回收率(%)123456諾龍7.110.071.0雄烯二酮13.8.69.310.510.0105表睪酮7.510.075.0甲睪酮10.511.510.610.912.99.911.110.0110炔諾酮9.011.3102孕酮10.08.912.010.610.0106甲地孕酮12.812.49.511.410.0114甲羥孕酮11.98.513.010.510.0105可的松7.910.079.0氫化可的松8.910.089.0地塞米松9.910.510.610.210.0102雌酮8.010.083.017-α雌二醇9.811.28.99.09.696.017β-雌二醇10.49.612.09.511.49.510.410.0104雌三醇8.89.410.49.510.611.110.010.0100表6-7中濃度樣品測試的正確度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)值(ng/L)回收率(%)123456諾龍15.313.112.516.515.614.614.620.073.0雄烯二酮21.422.020.820.517.821.320.620.0103表睪酮16.514.517.718.015.823.717.720.088.5甲睪酮14.617.621.121.021.421.019.420.097.0炔諾酮24.719.720.920.624.721.822.120.0110孕酮19.119.619.518.319.020.519.320.096.7甲地孕酮19.119.721.820.220.0101甲羥孕酮20.621.319.725.319.421.721.320.0107可的松21.920.719.723.116.720.520.420.0102氫化可的松20.918.526.023.122.324.322.520.0113地塞米松17.916.814.515.520.085.0雌酮23.523.524.322.820.011417-α雌二醇24.222.918.321.824.824.822.820.011417β-雌二醇17.921.119.319.826.624.721.620.0108雌三醇21.925.426.019.717.722.822.220.0111表6-8高濃度樣品測試的正確度數(shù)據(jù)化合物測定值(ng/L)平均值(ng/L)標(biāo)準(zhǔn)值(ng/L)回收率(%)123456諾龍33.232.736.231.036.230.733.350.066.6雄烯二酮50.666.765.345.355.964.758.150.0116表睪酮61.547.758.748.040.950.051.050.0102甲睪酮53.835.436.845.437.753.343.750.087.4炔諾酮55.664.552.757.556.651.956.550.0113孕酮50.849.551.453.453.755.052.350.0104甲地孕酮64.752.666.647.252.743.954.650.0109甲羥孕酮36.733.340.540.241.747.339.550.079.9可的松48.451.048.348.648.946.148.650.097.1氫化可的松64.564.757.758.956.952.659.250.0118地塞米松43.240.849.345.251.455.247.550.095.0雌酮63.654.661.259.860.151.558.550.011717-α雌二醇40.556.059.058.350.010517β-雌二醇48.763.958.945.461.961.456.750.0113雌三醇40.041.745.242.440.740.041.750.083.36.7結(jié)果計(jì)算與表示6.7.1定性分析在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)；每種化合物的質(zhì)譜定性離子至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，且樣品中各組分定性離子的相對豐度與濃度接近的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表6-9規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。表6-9定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差單位：%相對離子豐度KK＞5020＜K＜5010＜K＜20K≤10允許最大偏差202530506.7.2定量分析采用內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)平均相對響應(yīng)因子計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)系列第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對響應(yīng)因子RRF，按照公式（1）計(jì)算?！?）式中：RRFi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對響應(yīng)因子，無量綱；

Ai——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物定量離子的峰面積（或峰高）；

Ais——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物對應(yīng)內(nèi)標(biāo)定量離子的定量離子的峰面積（或峰高）；

——標(biāo)準(zhǔn)系列中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；

——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，μg/L。目標(biāo)化合物或替代物的平均相對響應(yīng)因子用公式（2）計(jì)算?！?）式中：——目標(biāo)化合物或替代物的平均相對響應(yīng)因子，無量綱；RRFi——標(biāo)準(zhǔn)系列中第i點(diǎn)目標(biāo)化合物或替代物的相對響應(yīng)因子，無量綱；

n——標(biāo)準(zhǔn)系列點(diǎn)數(shù)。試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，按公式（3）計(jì)算?！?）式中：——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，μg/L；Ax——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的峰面積（或峰高）；Ais——試樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積，（或峰高）；——試樣中內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度，μg/L；——目標(biāo)化合物或替代物的平均相對響應(yīng)因子，無量綱；樣品中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度按公式（4）計(jì)算?！?）式中：——樣品中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，單位為納克每升（ng/L）；——試樣中目標(biāo)化合物或替代物的質(zhì)量濃度，單位為微克每升（μg/L）；V1——試樣定容體積，單位為毫升（mL）；V0——取樣體積，單位為升（L）；D——稀釋倍數(shù)。6.7.3結(jié)果表示測定結(jié)果小數(shù)點(diǎn)后位數(shù)的保留與方法檢出限一致，最多保留三位有效數(shù)字。7方法驗(yàn)證7.1方法驗(yàn)證方案7.1.1參與方法驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)室、驗(yàn)證人員的基本情況組織6家實(shí)驗(yàn)室參加了方法驗(yàn)證工作，具體參加人員名單如下表7-1。表7-1參加驗(yàn)證的人員情況登記表姓名性別年齡職務(wù)或職稱所學(xué)專業(yè)從事相關(guān)分析工作年限驗(yàn)證單位韋業(yè)男42工程師環(huán)境工程14廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)監(jiān)測中心吳鑫男38副科長生物技術(shù)7廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心張文武男25一級科員環(huán)境工程3廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心黃仕英女46工程師應(yīng)用化學(xué)13廣西壯族自治區(qū)北海生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心高桂蘭女47教授分析化學(xué)21上海第二工業(yè)大學(xué)房琴女25/資源與環(huán)境6上海第二工業(yè)大學(xué)陳帥男36副教授環(huán)境工程9上海第二工業(yè)大學(xué)張雅迪女22/資源與環(huán)境1上海第二工業(yè)大學(xué)竇立群男23/資源與環(huán)境5上海第二工業(yè)大學(xué)張鵬男35副教授海洋化學(xué)3廣東海洋大學(xué)張際標(biāo)男52教授海洋化學(xué)20廣東海洋大學(xué)趙利容女46副教授海洋化學(xué)14廣東海洋大學(xué)李業(yè)燕女36高級工程師環(huán)境科學(xué)11年廣西壯族自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院宋寶男27助理工程師應(yīng)用化學(xué)3年廣西壯族自治區(qū)環(huán)境科學(xué)研究院根據(jù)影響方法的精密度和正確度的主要因素和數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求，編制方法驗(yàn)證報告，驗(yàn)證數(shù)據(jù)主要包括檢出限、測定下限、精密度以及實(shí)際樣品加標(biāo)回收率等。7.1.2方法驗(yàn)證方案如下：方法檢出限測定：配制濃度為5.0ng/L空白水加標(biāo)樣7份進(jìn)行全過程分析測定，計(jì)算7次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S，此時檢出限公式MDL＝S×3.143。方法的測定下限：參照HJ168，以4倍方法檢出限確定為本方法目標(biāo)物的測定下限。方法精密度測定：配制濃度為10.0ng/L、20ng/L和50ng/L的海水加標(biāo)樣品，每個濃度水平各6份平行樣進(jìn)行全過程分析，對上述測定結(jié)果后將各自6次的結(jié)果計(jì)算平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。加標(biāo)回收率：在海水樣品加入標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為10.0ng/L、20ng/L和50ng/L，平行配制6份，經(jīng)全過程分析測定，后將6次測定結(jié)果，分別計(jì)算平均值、加標(biāo)回收率等。7.2方法驗(yàn)證過程通過篩選確定有資質(zhì)方法驗(yàn)證單位。按照方法驗(yàn)證方案準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)用品，與驗(yàn)證單位確定驗(yàn)證時間。在方法驗(yàn)證前，確保參加驗(yàn)證的操作人員應(yīng)熟悉和掌握方法原理、操作步驟及流程。方法驗(yàn)證過程中所用的試劑和材料、儀器和設(shè)備及分析步驟應(yīng)符合方法相關(guān)要求。7.3方法驗(yàn)證結(jié)論（1）由于不同品牌、不同型號液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀靈敏度可能會有差異，本標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)行方法驗(yàn)證時，盡可能選擇了覆蓋市場的不同品牌液質(zhì)聯(lián)用儀，獲得的數(shù)據(jù)能夠全面反映各種品牌型號儀器的檢出限水平。本方法檢出限為1.6ng/L～3.9ng/L。（2）本課題組在進(jìn)行方法驗(yàn)證報告數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時，異常值的檢驗(yàn)和處理按照GB/T6379.6-2009標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，在統(tǒng)計(jì)分析時未發(fā)現(xiàn)異常值。（3）方法精密度和準(zhǔn)確度統(tǒng)計(jì)結(jié)果能滿足方法特性指標(biāo)要求。詳細(xì)結(jié)果見附件《方法驗(yàn)證報告》。8重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)本文件研制過程中無重大分歧意見。9自我承諾承諾標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容和各項(xiàng)指標(biāo)不低于國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)。也不存在內(nèi)容或某項(xiàng)指標(biāo)低于推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)的情況。參考文獻(xiàn)馬帥,韓平,馮曉元.土壤環(huán)境中類固醇激素的來源?環(huán)境行為及檢測研究[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2015(03):41-46+62.ZHONGR,ZOUH,GAOJ,etal.AcriticalreviewonthedistributionandecologicalriskassessmentofsteroidhormonesintheenvironmentinChina[J].SciTotalEnviron,2021,786:147452.LIUS,CHENH,ZHOUGJ,etal.Occurrence,source,analysisandriskassessmentofandrogens,glucocorticoidsandprogestagensintheHailingBayregion,SouthChinaSea[J].SciTotalEnviron,2015,536:99-107.KiddKA，BlanchfieldPJ，MillsKH，etal．Collapseofafishpopulationafterexposuretoasyntheticestrogen［J］．ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica，2007，104(21):8897-8901．KugathasS,RunnallsTJ,SumpterJP.Metabolicandreproductiveeffectsofrelativelylowconcentrationsofbeclomethasonedipropionate,asyntheticglucocorticoid,onfatheadminnows[J].Environmentalscience&technology,2013,47(16):9487-9495.LarsenMG,BaatrupE.Functionalbehaviorandreproductioninandrogenicsexreversedzebrafish(Daniorerio)[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry,2010,29(8):1828-1833.Kidd,K.A.,Graves,S.D.,McKee,G.I.,Dyszy,K.,Podemski,C.L.,2020.Effectsofwhole-lakeadditionsofethynylestradiolonleechpopulations.Environ.Toxicol.Chem.39(8),1608–1619./10.1002/etc.4789.Kidd,K.A.,Paterson,M.J.,Rennie,M.D.,Podemski,C.L.,Findlay,D.L.,Blanchfield,P.J.,Liber,K.,2014.Directandindirectresponsesofafreshwaterfoodwebtoapotentsyntheticoestrogen.Phil.Trans.R.Soc.BBiol.Sci.369(1656),20130578./10.1098/rstb.2013.0578.LiuS,ChenH,XuXR,etal.Threeclassesofsteroidsintypicalfreshwateraquaculturefarms:Comparisontomarineaquaculturefarms[J].ScienceoftheTotalEnvironment,2017,609:942.DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.07.207.PeckM,GibsonRW,KortenkampA,etal.SedimentsaremajorsinksofsteroidalestrogensintwoUnitedKingdomrivers[J].EnvironmentalToxicologyandChemistry,2004,23(4):945-952.汪福順,劉叢強(qiáng),灌瑾,等.貴州阿哈水庫沉積物中重金屬二次污染的趨勢分析[J].長江流域資源與環(huán)境,2009,18(4):379-383.米曉霞,李思聰,王凱強(qiáng),等.豬血漿中33種類固醇激素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[J].分析測試學(xué)報）,2014,33(8):873-880.李貴洪,譚紅,梁發(fā)明等.環(huán)境水體中類固醇激素的分析方法研究進(jìn)展[J].貴州科學(xué),2016,34(02):64-69.ChenCY,WenTY,WangGS,etal.SciTotalEnviron,2007,378(3):352.KumarV,NakadaN,YasojimM,etal.Chemosphere,2009,77(10):1440.王玲.環(huán)境中類固醇類內(nèi)分泌干擾物的檢測技術(shù)及其降解行為研究[D].山東大學(xué),2007.DOI:10.7666/d.y1067759.馮慧,徐欣,彭鵬等.環(huán)境固體樣品中多種甾體激素的同步檢測方法及條件優(yōu)化[J].中國環(huán)境監(jiān)測,2023,39(02):214-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