流式細胞術(shù)原理及臨床應(yīng)用-文檔

流式細胞術(shù)的原理及臨床應(yīng)用

流式細胞術(shù)(flowcytometryFCM)是利用流式細胞儀對單個生物顆粒(紅細胞、白細胞、各類組織細胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物學特性進行多參數(shù)定量分析，并能對特定細胞群體加以分選的分析技術(shù)。流式細胞術(shù)的概念流式細胞術(shù)特點快速檢測流動的單細胞或顆粒，達上萬個/每秒檢測物可以是細胞、細菌或各種微粒，0.5-50mm范圍內(nèi)

多參數(shù)同時分析，F(xiàn)S/SS/FLs(熒光)

可分析，可分選特點

FCM的工作原理

流式細胞儀組成：1.液流系統(tǒng)：樣本被制備成單個細胞的懸液，經(jīng)熒光染料標記的抗體染色后置入樣品管中，在氣體壓力下使其形成單細胞液柱。2.光學系統(tǒng)：由激發(fā)光源、分光鏡、光束成形器等組成。

散射光信號：

前向散射光（FS）：在激光束正前方，用于檢測細胞或其他粒子物體的表面屬性，反映細胞顆粒的大小。

側(cè)向散射光（sidescatter，SS）：與激光束垂直方向，主要用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復雜程度、表面的光滑程度。熒光信號：每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長，受激光激發(fā)后會產(chǎn)生特定波長的熒光和顏色。流式細胞儀利用不同波長的光學濾片來檢測這些特定發(fā)射波長的光學信號。熒光信號反映被染上熒光的細胞數(shù)量多少。

FCM的工作原理

流式細胞儀組成：3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)主要由計算機及其軟件組成。通過檢測散射光及熒光信號對實驗數(shù)據(jù)進行分析、存儲、顯示?？捎昧魇郊毎麅x分析的標本

外周血、骨髓、癌組織、癌旁組織、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）

必需制備成單細胞懸液單細胞生物、特殊處理的植物細胞、某些非細胞粒子、可溶性分子

流式細胞儀的基本功能細胞表型分析：包括細胞膜、胞漿內(nèi)蛋白表達及核膜成份分析DNA含量及細胞周期分析、細胞凋亡檢測目標細胞分選自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析、自身抗體的檢測流式蛋白定量技術(shù)：血漿中各種細胞因子的含量

臨床免疫學臨床血液學臨床腫瘤學血栓與止血骨髓和器官移植基礎(chǔ)醫(yī)學研究流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用（一）FCM在臨床免疫學中的應(yīng)用機體免疫狀態(tài)是衡量機體是否罹患疾病的重要指標，采用流式細胞術(shù)來檢測淋巴細胞亞群，評估機體的免疫狀態(tài)。T淋巴細胞進一步細分：

CD4+:Th1:介導細胞免疫、參與自身免疫性疾病與炎癥反應(yīng)。Th2:介導體液免疫，參與過敏反應(yīng)和體液免疫性疾病CD8+：

細胞毒性TCD8+CD28+：釋放細胞毒素，殺死靶細胞抑制性T淋巴細胞CD8+CD28-:抑制某些淋巴細胞的活性淋巴細胞細胞亞群臨床意義;測定人類淋巴細胞亞群的變化，對早期發(fā)現(xiàn)和控制疾病，指導臨床治療，評估機體免疫狀態(tài)有著非常重要意義。

自身免疫性疾?。?/p>

SLE

CD4+細胞、CD4/CD8比值↓，CD8+細胞↑

免疫缺陷性疾?。?/p>

AIDSCD4+細胞、CD4/CD8比值↓

感染性疾?。翰《?、細菌、寄生蟲感染腫瘤免疫監(jiān)測：放療和化療可引起免疫抑制，免疫功能恢復慢提示預后較差，免疫恢復較快者，預后較好移植免疫監(jiān)測：CD3+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當其比值小于0.2時必需停用免疫抑制劑。HLA-B27:強直性脊柱炎外周血淋巴細胞HLA-B27的表達及其表達程度與強直性脊柱炎的發(fā)生有很大相關(guān)性，利用流式細胞術(shù)進行HLA-B27檢測，可同時排除交叉反應(yīng)，是目前檢測HLA-B27的最好方法。(二)FCM在臨床血液學中的應(yīng)用1.白血病的MIC分型

Morphology（形態(tài)學）

Immunology（免疫學）

Cytogenetics（細胞遺傳學）白血病免疫分型是MIC分型的重要組成部分，也是對FAB分型的補充，對白血病的診斷、治療策略制定、預后判斷及對白血病發(fā)病機制的研究都具有重要作用。免疫分型的臨床意義

彌補FAB分型的不足

診斷其他血液系統(tǒng)腫瘤

診斷僅表達個別非本系列相關(guān)抗原的急性白血?。↙Y+—AML、MY+—ALL）

急性雙系或雙表型白血病的診斷

骨髓增生異常綜合征（MDS）免疫表型分析的臨床意義

免疫分型對鑒別慢性淋巴細胞增生性疾病各亞型亦有肯定的診斷價值以下為各系列較特別的標志：

AML：

MPO、CD33、CDl3、CDl4CDl5、CDllb、CDllc

T-ALL：

c／mCD3、CD2、CD5、CD7、CD4／CD8、CD38

B-ALL：

cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLA—DR、CD20、

CD38

造血干／祖細胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植判斷采集的時機和數(shù)量：利用流式細胞儀可對造血干細胞動員過程中，外周血的造血干細胞（CD34）含量進行計數(shù)，判斷采集的時機和數(shù)量。移植后的患者進行監(jiān)控：當患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+

T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當其比值小于0.2時必需停用免疫抑制劑。

FCM檢測白血病微小殘留病變(MRD):

MRD是白血病復發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測是否有殘留病變細胞，早期探測MRD，以免復發(fā)

FCM在臨床腫瘤學中的應(yīng)用1.血液標本的檢查腫瘤患者的免疫功能檢查腫瘤患者的粘附分子檢查：在腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD1062.腫瘤實體標本的FCM檢查細胞DNA分析腫瘤細胞耐藥性細胞凋亡檢查腫瘤相關(guān)抗原激素受體與癌細胞生物行為有關(guān)的因子，如CD44

利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等)與細胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被這些熒光染料染色的細胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DNA含量。細胞DNA分析原理細胞周期與DNA的倍體關(guān)系DNA非2倍體出現(xiàn)是鑒別良性與惡性腫瘤的特異性指標:良性腫瘤和正常組織良性增生不出現(xiàn)DNA非2倍體細胞而惡性腫瘤常可出現(xiàn)異倍體細胞；實體惡性腫瘤的非2倍體出現(xiàn)率>70%如果交界性腫瘤出現(xiàn)異倍體即已具有惡性特征,盡管病理形態(tài)學尚不能證實,也應(yīng)視為惡性。ＤＮＡ倍體檢測轉(zhuǎn)移性癌良性反應(yīng)性增生早期診斷

FCM通過精確定量DNA含量，能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷為治療方案和藥理學研究提供依據(jù)：可利用FCM進行細胞周期分析，適當選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。判斷預后DNA異倍體、高S期細胞比值和高增殖細胞核抗原（PCNA）表達與細胞增殖能力、惡性程度和不良預后呈正相關(guān)。細胞DNA分析臨床意義

腫瘤細胞耐藥性

MDR是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）親脂化合物，包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。當淋巴細胞出現(xiàn)MDR陽性細胞時，患者對化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性，需要考慮其他治療方式

細胞死亡分兩種：凋亡和壞死細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等的作用；是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。

壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應(yīng)

凋亡的檢測細胞凋亡的生物學意義

胚胎形成、肌體正常發(fā)育、衰老和損傷細胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等都與細胞凋亡有關(guān)。生物醫(yī)學的研究熱點FCM在血栓性疾與止血中應(yīng)用

由于活化血小板是血栓的主要