流式細(xì)胞術(shù)原理及臨床應(yīng)用-文檔

流式細(xì)胞術(shù)的原理及臨床應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometryFCM)是利用流式細(xì)胞儀對(duì)單個(gè)生物顆粒(紅細(xì)胞、白細(xì)胞、各類組織細(xì)胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物學(xué)特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析，并能對(duì)特定細(xì)胞群體加以分選的分析技術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)的概念流式細(xì)胞術(shù)特點(diǎn)快速檢測(cè)流動(dòng)的單細(xì)胞或顆粒，達(dá)上萬個(gè)/每秒檢測(cè)物可以是細(xì)胞、細(xì)菌或各種微粒，0.5-50mm范圍內(nèi)

多參數(shù)同時(shí)分析，F(xiàn)S/SS/FLs(熒光)

可分析，可分選特點(diǎn)

FCM的工作原理

流式細(xì)胞儀組成：1.液流系統(tǒng)：樣本被制備成單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體染色后置入樣品管中，在氣體壓力下使其形成單細(xì)胞液柱。2.光學(xué)系統(tǒng)：由激發(fā)光源、分光鏡、光束成形器等組成。

散射光信號(hào)：

前向散射光（FS）：在激光束正前方，用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子物體的表面屬性，反映細(xì)胞顆粒的大小。

側(cè)向散射光（sidescatter，SS）：與激光束垂直方向，主要用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，反映顆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度、表面的光滑程度。熒光信號(hào)：每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長(zhǎng)，受激光激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的熒光和顏色。流式細(xì)胞儀利用不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來檢測(cè)這些特定發(fā)射波長(zhǎng)的光學(xué)信號(hào)。熒光信號(hào)反映被染上熒光的細(xì)胞數(shù)量多少。

FCM的工作原理

流式細(xì)胞儀組成：3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)主要由計(jì)算機(jī)及其軟件組成。通過檢測(cè)散射光及熒光信號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、存儲(chǔ)、顯示。可用流式細(xì)胞儀分析的標(biāo)本

外周血、骨髓、癌組織、癌旁組織、各種體液（尿、腦脊液、胸腹水、肺泡灌洗液等）

必需制備成單細(xì)胞懸液?jiǎn)渭?xì)胞生物、特殊處理的植物細(xì)胞、某些非細(xì)胞粒子、可溶性分子

流式細(xì)胞儀的基本功能細(xì)胞表型分析：包括細(xì)胞膜、胞漿內(nèi)蛋白表達(dá)及核膜成份分析DNA含量及細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡檢測(cè)目標(biāo)細(xì)胞分選自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析、自身抗體的檢測(cè)流式蛋白定量技術(shù)：血漿中各種細(xì)胞因子的含量

臨床免疫學(xué)臨床血液學(xué)臨床腫瘤學(xué)血栓與止血骨髓和器官移植基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究流式細(xì)胞術(shù)的臨床應(yīng)用（一）FCM在臨床免疫學(xué)中的應(yīng)用機(jī)體免疫狀態(tài)是衡量機(jī)體是否罹患疾病的重要指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群，評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)。T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分：

CD4+:Th1:介導(dǎo)細(xì)胞免疫、參與自身免疫性疾病與炎癥反應(yīng)。Th2:介導(dǎo)體液免疫，參與過敏反應(yīng)和體液免疫性疾病CD8+：

細(xì)胞毒性TCD8+CD28+：釋放細(xì)胞毒素，殺死靶細(xì)胞抑制性T淋巴細(xì)胞CD8+CD28-:抑制某些淋巴細(xì)胞的活性淋巴細(xì)胞細(xì)胞亞群臨床意義;測(cè)定人類淋巴細(xì)胞亞群的變化，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)和控制疾病，指導(dǎo)臨床治療，評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)有著非常重要意義。

自身免疫性疾病：

SLE

CD4+細(xì)胞、CD4/CD8比值↓，CD8+細(xì)胞↑

免疫缺陷性疾?。?/p>

AIDSCD4+細(xì)胞、CD4/CD8比值↓

感染性疾?。翰《尽⒓?xì)菌、寄生蟲感染腫瘤免疫監(jiān)測(cè)：放療和化療可引起免疫抑制，免疫功能恢復(fù)慢提示預(yù)后較差，免疫恢復(fù)較快者，預(yù)后較好移植免疫監(jiān)測(cè)：CD3+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當(dāng)其比值小于0.2時(shí)必需停用免疫抑制劑。HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎外周血淋巴細(xì)胞HLA-B27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生有很大相關(guān)性，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行HLA-B27檢測(cè)，可同時(shí)排除交叉反應(yīng)，是目前檢測(cè)HLA-B27的最好方法。(二)FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用1.白血病的MIC分型

Morphology（形態(tài)學(xué)）

Immunology（免疫學(xué)）

Cytogenetics（細(xì)胞遺傳學(xué)）白血病免疫分型是MIC分型的重要組成部分，也是對(duì)FAB分型的補(bǔ)充，對(duì)白血病的診斷、治療策略制定、預(yù)后判斷及對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的研究都具有重要作用。免疫分型的臨床意義

彌補(bǔ)FAB分型的不足

診斷其他血液系統(tǒng)腫瘤

診斷僅表達(dá)個(gè)別非本系列相關(guān)抗原的急性白血病（LY+—AML、MY+—ALL）

急性雙系或雙表型白血病的診斷

骨髓增生異常綜合征（MDS）免疫表型分析的臨床意義

免疫分型對(duì)鑒別慢性淋巴細(xì)胞增生性疾病各亞型亦有肯定的診斷價(jià)值以下為各系列較特別的標(biāo)志：

AML：

MPO、CD33、CDl3、CDl4CDl5、CDllb、CDllc

T-ALL：

c／mCD3、CD2、CD5、CD7、CD4／CD8、CD38

B-ALL：

cCD22、cCD79、CDl9、CDl0、CD24、HLA—DR、CD20、

CD38

造血干／祖細(xì)胞:CD34、CDll7、CD38、HLA-DR、ACl33造血干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血干細(xì)胞移植判斷采集的時(shí)機(jī)和數(shù)量：利用流式細(xì)胞儀可對(duì)造血干細(xì)胞動(dòng)員過程中，外周血的造血干細(xì)胞（CD34）含量進(jìn)行計(jì)數(shù)，判斷采集的時(shí)機(jī)和數(shù)量。移植后的患者進(jìn)行監(jiān)控：當(dāng)患者CD3+、CD25+持續(xù)增加提示已開始發(fā)生排異，CD4+/CD8+

T持續(xù)下降，表明有感染發(fā)生，當(dāng)其比值小于0.2時(shí)必需停用免疫抑制劑。

FCM檢測(cè)白血病微小殘留病變(MRD):

MRD是白血病復(fù)發(fā)的主要根源，F(xiàn)CM的高特異性和敏感性可以在患者緩解期檢測(cè)是否有殘留病變細(xì)胞，早期探測(cè)MRD，以免復(fù)發(fā)

FCM在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用1.血液標(biāo)本的檢查腫瘤患者的免疫功能檢查腫瘤患者的粘附分子檢查：在腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。ICAM-1CD54ICAM-2CD102ICAM-3CD1062.腫瘤實(shí)體標(biāo)本的FCM檢查細(xì)胞DNA分析腫瘤細(xì)胞耐藥性細(xì)胞凋亡檢查腫瘤相關(guān)抗原激素受體與癌細(xì)胞生物行為有關(guān)的因子，如CD44

利用特殊的熒光染料(PI、EB、AO等)與細(xì)胞內(nèi)DNA堿基結(jié)合，被這些熒光染料染色的細(xì)胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。流式細(xì)胞儀通過測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度推算出細(xì)胞的DNA含量。細(xì)胞DNA分析原理細(xì)胞周期與DNA的倍體關(guān)系DNA非2倍體出現(xiàn)是鑒別良性與惡性腫瘤的特異性指標(biāo):良性腫瘤和正常組織良性增生不出現(xiàn)DNA非2倍體細(xì)胞而惡性腫瘤?？沙霈F(xiàn)異倍體細(xì)胞；實(shí)體惡性腫瘤的非2倍體出現(xiàn)率>70%如果交界性腫瘤出現(xiàn)異倍體即已具有惡性特征,盡管病理形態(tài)學(xué)尚不能證實(shí),也應(yīng)視為惡性。ＤＮＡ倍體檢測(cè)轉(zhuǎn)移性癌良性反應(yīng)性增生早期診斷

FCM通過精確定量DNA含量，能對(duì)癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢(shì)作出判斷，有助于癌前病變的早期診斷為治療方案和藥理學(xué)研究提供依據(jù)：可利用FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析，適當(dāng)選擇周期特異性藥物或非周期特異性藥物。判斷預(yù)后DNA異倍體、高S期細(xì)胞比值和高增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)與細(xì)胞增殖能力、惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)。細(xì)胞DNA分析臨床意義

腫瘤細(xì)胞耐藥性

MDR是由多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白（P-gp）親脂化合物，包括多種抗癌藥物和熒光染料的跨膜性排出泵。當(dāng)淋巴細(xì)胞出現(xiàn)MDR陽性細(xì)胞時(shí)，患者對(duì)化療藥物開始出現(xiàn)耐藥性，需要考慮其他治療方式

細(xì)胞死亡分兩種：凋亡和壞死細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用；是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。

壞死（necrosis）：壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細(xì)胞脹大，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)

凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義

胚胎形成、肌體正常發(fā)育、衰老和損傷細(xì)胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。生物醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)FCM在血栓性疾與止血中應(yīng)用

由于活化血小板是血栓的主要