色譜分離原理

關(guān)于色譜分離原理18-1概述色譜發(fā)展簡史色譜法在工業(yè)生產(chǎn)和科學研究中的作用色譜法的定義與分類第2頁,共144頁，星期六，2024年，5月一、色譜發(fā)展簡史色譜法的出現(xiàn)色譜法的發(fā)展色譜法的現(xiàn)狀和未來？第3頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的出現(xiàn)1903年Tswett（茨維特）研究植物葉子組成時發(fā)明了色譜法第4頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的出現(xiàn)1903年Tswett（茨維特）研究植物葉子組成時發(fā)明了色譜法第5頁,共144頁，星期六，2024年，5月1906年Tswett的研究成果發(fā)表Chromatographie(德語）

Chromatography(英語）色譜玻璃管=“色譜柱”column碳酸鈣=“固定相”stationaryphase石油醚=“流動相”mobilephase第6頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的發(fā)展1931年Kuhn等用氧化鋁和碳酸鈣分離了α-,β-,γ-胡蘿卜素等60多種植物色素1941年Martin和Synge建立了液液分配色譜法并提出氣相色譜的設(shè)想1952年Martin等發(fā)明了氣液色譜法1952年Martin和Synge獲得諾貝爾化學獎第7頁,共144頁，星期六，2024年，5月A.J.P.Martin第8頁,共144頁，星期六，2024年，5月R.L.M.Synge第9頁,共144頁，星期六，2024年，5月氣相色譜儀第10頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的發(fā)展1957年Goley開創(chuàng)了毛細管氣相色譜1960年代末出現(xiàn)高效液相色譜法1980年代超臨界流體色譜得到發(fā)展1980年代Jorgeson發(fā)展了高效毛細管電泳1990年代后期毛細管電色譜得到重視和發(fā)展第11頁,共144頁，星期六，2024年，5月高效液相色譜儀第12頁,共144頁，星期六，2024年，5月毛細管電泳儀第13頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜分離速度的變化第14頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的現(xiàn)狀和未來氣相色譜和高效液相色譜發(fā)展最好超臨界流體色譜處于失利地位毛細管電泳與毛細管電色譜處于研究階段,進入部分應用領(lǐng)域第15頁,共144頁，星期六，2024年，5月氣相色譜和高效液相色譜發(fā)展最好氣相色譜儀及備件全球市場:約10億美元/年;3-4%年增長高效液相色譜儀及備件6-8%年增長第16頁,共144頁，星期六，2024年，5月超臨界流體色譜處于失利地位發(fā)展晚于GC和HPLC雖然具有一些獨特用途，但大多數(shù)功能可由GC和HPLC代替第17頁,共144頁，星期六，2024年，5月毛細管電泳與毛細管電色譜為基因組學研究作出了杰出貢獻目前存在的主要問題：分析結(jié)果偏差大比HPLC大一個數(shù)量級機遇：分離分析生物大分子第18頁,共144頁，星期六，2024年，5月成功的定量分析方法應具備的基本條件易于使用，操作費用低能夠得到準確、可重復的定量結(jié)果要能夠解決至少一個分析化學中的重要問題第19頁,共144頁，星期六，2024年，5月

色譜法在工業(yè)生產(chǎn)和科學研究中的作用1930-1940年代為分離復雜的生物組成發(fā)揮了獨特作用1950年代為石油工業(yè)的發(fā)展作出了貢獻1960-1970年代成為石油化工、化學工業(yè)等部門的分析檢測手段目前，色譜法已成為生命科學、醫(yī)藥科學、環(huán)境科學、材料科學、食品科學、法庭科學以及航天科學等研究領(lǐng)域的重要手段第20頁,共144頁，星期六，2024年，5月面臨的問題當今化學、生命科學、環(huán)境科學等研究領(lǐng)域中備受人們關(guān)注的熱點問題，如蛋白質(zhì)組學、代謝組學中的分離分析問題的解決，醫(yī)學中的藥理、藥物代謝研究和疾病標記物研究，天然產(chǎn)物有效成分的分離分析，食品安全，毒品、興奮劑等快速檢測等等。復雜體系第21頁,共144頁，星期六，2024年，5月樣品制備檢測GC,HPLC,CE,CEC,micro-TAS……SP(M)E等分離第22頁,共144頁，星期六，2024年，5月發(fā)展趨勢進一步發(fā)展高效分離技術(shù)小型化、微型化、自動化各種聯(lián)用技術(shù)樣品處理技術(shù)高通量第23頁,共144頁，星期六，2024年，5月超高效液相色譜（UPLC）chromatogramobtainedunderisocraticconditionsona43cmlongcapillarycolumnpackedwith1.0μmnon-porousC18particles(EichromScientific).第24頁,共144頁，星期六，2024年，5月超高效液相色譜（UPLC）Thesamplewasrunusingconstant-flowpumpsat52000psiona38cmlongcapillarypackedwith1.0μmC18particles.第25頁,共144頁，星期六，2024年，5月芯片液相色譜

ZORBAX300SBC185μmparticlesH.-F.Yinetal.,presentedatthe18thInternationalSymposiumonMicroscaleSeparationsandAnalysis,HPCE,SanDiego,January2003.第26頁,共144頁，星期六，2024年，5月多肽分離圖第27頁,共144頁，星期六，2024年，5月自動化第28頁,共144頁，星期六，2024年，5月分離分析新技術(shù)簡介毛細管電泳全二維氣相色譜液相色譜－氣相色譜聯(lián)用液相色譜－液相色譜聯(lián)用色譜－質(zhì)譜聯(lián)用*樣品處理技術(shù)第29頁,共144頁，星期六，2024年，5月毛細管電泳

毛細管電泳是指溶質(zhì)以電場為推動力，在毛細管中按淌度差別而實現(xiàn)的高效、快速分離的新型電泳技術(shù)。第30頁,共144頁，星期六，2024年，5月高效毛細管電泳的特點與傳統(tǒng)電泳技術(shù)及現(xiàn)代色譜技術(shù)相比：儀器簡單、操作方便、易自動化分離效率高(105-107

塊/m)、分析速度快操作模式多實驗成本低，消耗少重現(xiàn)較差，分析結(jié)果誤差大第31頁,共144頁，星期六，2024年，5月毛細管電泳示意圖第32頁,共144頁，星期六，2024年，5月多維氣相色譜第33頁,共144頁，星期六，2024年，5月全二維氣相色譜第34頁,共144頁，星期六，2024年，5月全二維氣相色譜第35頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜－氣相色譜聯(lián)用第36頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜－氣相色譜聯(lián)用橄欖油有機酸第37頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜－液相色譜聯(lián)用第38頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜－液相色譜聯(lián)用模式同模式LC–LC多模式LC–LC全二維LC(i)樣品的每一部分均經(jīng)過二維分離。(ii)樣品的所有組分等比例經(jīng)過二維分離。(iii)第一維具備分離能力。第39頁,共144頁，星期六，2024年，5月全二維LC第40頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)Fig.1-2SPMEconstruction第41頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)Fig.1-5DesorptionchamberforcouplingSPMEtoHPLCFig.1-6CommerciallyavailableinterfaceofSPME-HPLC(Supelco)第42頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)第43頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)第44頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)Monolithiccapillary專利申請?zhí)枺?00520095986.1第45頁,共144頁，星期六，2024年，5月固相微萃取技術(shù)第46頁,共144頁，星期六，2024年，5月三、色譜法的定義與分類色譜法是一種物理化學分析方法，它利用混合物中各物質(zhì)在兩相（固定相和流動相）間的分配系數(shù)的差別，當兩相作相對運動時，各物質(zhì)隨流動相運動，并在兩相間進行多次分配，從而使各組分得到分離。第47頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜法的分類按固定相的使用形式按流動相的物理狀態(tài)按分離機理按色譜操作方式不同按流動相和固定相的極性不同按用途不同分類第48頁,共144頁，星期六，2024年，5月按固定相的使用形式分類柱色譜(columnchromatography)平板色譜(planarchromatography)紙色譜(paperchromatography)薄層色譜(thinlayerchromatography)第49頁,共144頁，星期六，2024年，5月按流動相的物理狀態(tài)分類氣相色譜氣固色譜氣液色譜液相色譜液液色譜液固色譜超臨界流體色譜

第50頁,共144頁，星期六，2024年，5月按分離機理分類分配色譜(partitionchromatography)吸附色譜(adsorptionchromatography)離子交換色譜(ionexchangechromatography)排阻色譜(sizeexclusionchromatography)親和色譜(affinitychromatography)第51頁,共144頁，星期六，2024年，5月按色譜操作方式不同分類迎頭色譜(frontalchromatography)頂替色譜(displacementchromatography)洗脫色譜(elutionchromatography)第52頁,共144頁，星期六，2024年，5月洗脫色譜（沖洗）這是色譜過程最常用的方法。將試樣加入色譜柱的入口端，然后用流動相沖洗柱子，由于各組分在固定相上的吸附（或溶解）能力不同，于是被流動相帶出的時間不同。第53頁,共144頁，星期六，2024年，5月按流動相和固定相的極性不同正相色譜（流動相極性小于固定相）反相色譜（流動相極性大于固定相）第54頁,共144頁，星期六，2024年，5月按用途不同分類分析型色譜制備型色譜流程色譜第55頁,共144頁，星期六，2024年，5月18-2色譜基本術(shù)語多環(huán)芳烴HPLC色譜圖第56頁,共144頁，星期六，2024年，5月一、基線（baseline)僅有流動相通過時，檢測器響應信號的記錄值第57頁,共144頁，星期六，2024年，5月二、峰高h第58頁,共144頁，星期六，2024年，5月三、保留值死時間(tM)和保留時間(tR)第59頁,共144頁，星期六，2024年，5月三、保留值

死體積(VM)和保留體積(VR)死體積:色譜柱中不被固定相占據(jù)的空間以及進樣系統(tǒng)管道和檢測系統(tǒng)的總體積（VM=tM

Fc）保留體積:從注射樣品到色譜峰頂出現(xiàn)時，所通過色譜系統(tǒng)的流動相體積（VR=tR

Fc）第60頁,共144頁，星期六，2024年，5月三、保留值調(diào)整保留時間

(t’R)和調(diào)整保留體積(V’R)t’R=tR-tM

(溶質(zhì)在固定相中停留的總時間)V’R=VR-VM第61頁,共144頁，星期六，2024年，5月三、保留值相對保留值(

2,1)relativeretention在一定色譜條件下兩個組分的調(diào)整保留時間（體積）的比

2,1=t’R2/t’R1分離因子()separationfactor=t’R2/t’R1第62頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程保留因子k(retentionfactor)容量因子(capacityfactor)（分配比）在平衡狀態(tài)下組分在固定相與流動相中的質(zhì)量之比k=ns/nm

第63頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程溶質(zhì)通過色譜柱的速度或保留值的大小是由每一瞬間該溶質(zhì)在流動相中的分子分數(shù)決定的。設(shè)流動相的平均流速為u，溶質(zhì)x譜帶在色譜柱中的移動速度為uxux=RuR為溶質(zhì)x在流動相中分子數(shù)與總分子數(shù)之比第64頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程流動相平均流速u和溶質(zhì)譜帶移動速度ux

第65頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程

溶質(zhì)保留方程

kt第66頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程分離因子

=t’R2/t’R1=k2/k1分配系數(shù)K

稱為相比*第67頁,共144頁，星期六，2024年，5月四、溶質(zhì)保留方程根據(jù)保留體積與保留時間的關(guān)系k=(VR-VM)/VMVR=KVS+VM第68頁,共144頁，星期六，2024年，5月假如一個溶質(zhì)的分配比為0.2，則它在色譜柱的流動相中的百分率是多少？∵k=ns/nm=0.2∴nm=5ns

nm/n×100%=nm/(nm+ns)×100%=83.3%

習題

第69頁,共144頁，星期六，2024年，5月在某色譜條件下，組分A的保留時間為18min，組分B的保留時間為25.0min，其死時間為2min，試計算：

（1）組分B對A的相對保留值；

（2）組分A,B的保留因子；

（3）組分B通過色譜柱在流動相、固定相保留的時間是多少？各占保留時間分數(shù)為多少？解：（1）組分B對A的相對保留值

rB/A=tB’/tA’=(25-2)/(18-2)＝1.44（2）組分A,B的保留因子

rA=(18-2)/2=8.0rB=(25-2)/2=11.5（3）組分B通過色譜柱在流動相保留的時間是tM=2min；在固定相保留的時間tB’=25-2=23min。各占保留時間分數(shù)的8％和92％。第70頁,共144頁，星期六，2024年，5月五、區(qū)域?qū)挾葮藴势?/p>

半峰寬Y1/2基線寬度Y第71頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜流出曲線標準偏差半峰寬基線寬度第72頁,共144頁，星期六，2024年，5月半峰寬度、基線寬度

與標準偏差的關(guān)系第73頁,共144頁，星期六，2024年，5月18-3色譜法基本理論色譜分離過程塔板理論速率理論第74頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離過程第75頁,共144頁，星期六，2024年，5月改進分離的兩種途徑第76頁,共144頁，星期六，2024年，5月塔板理論(Martin&Synge)色譜柱是由一系列連續(xù)的、相等的水平理論塔板組成在每一塊塔板(高度H)中溶質(zhì)可以在流動相與固定相中迅速達到平衡。H稱為理論塔板高度。流動相進入色譜柱不是連續(xù)進行的，而是脈動式，每次進入的流動相體積為一個塔板體積。所有組分開始時存在于第0號塔板上，且試樣的縱向擴散可忽略。分配系數(shù)在所有塔板上是常數(shù)，與組分在某一塔板上的量無關(guān)。第77頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜柱長：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：塔板理論(Martin&Synge)第78頁,共144頁，星期六，2024年，5月流出曲線方程當塔板數(shù)n>50,色譜流出曲線趨于正態(tài)分布c0

進樣濃度，c為時間t時柱出口濃度第79頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜流出曲線第80頁,共144頁，星期六，2024年，5月理論塔板數(shù)與理論塔板高度由塔板理論可以得到理論塔板數(shù)n與色譜峰半峰寬度或基線寬度的關(guān)系色譜峰越窄，理論塔板數(shù)越多，理論塔板高度越小，柱效能越高n和H可作為描述柱效能的指標第81頁,共144頁，星期六，2024年，5月有效塔板數(shù)和有效塔板高度同一色譜柱對不同物質(zhì)的柱效能是不一樣的，當用塔板數(shù)和塔板高度表示柱效能時，必須說明對什么物質(zhì)而言

第82頁,共144頁，星期六，2024年，5月塔板理論的成功與不足成功點：流出曲線的形狀濃度極大點的位置計算和評價柱效能的指標（n,H)第83頁,共144頁，星期六，2024年，5月塔板理論的成功與不足不足：無法回答的問題1.實驗參數(shù)如填料的大小、分子結(jié)構(gòu)、溫度等對色譜峰形以及塔板數(shù)和塔板高度的影響2.理論塔板高度與流速有關(guān)第84頁,共144頁，星期六，2024年，5月速率理論(vanDeemter)色譜峰展寬的因素速率理論方程其它因素第85頁,共144頁，星期六，2024年，5月（一）色譜峰展寬的因素渦流擴散（多流路擴散）分子擴散（縱向擴散）傳質(zhì)阻力①流動相傳質(zhì)阻力②固定相傳質(zhì)阻力第86頁,共144頁，星期六，2024年，5月渦流擴散第87頁,共144頁，星期六，2024年，5月渦流擴散dp是填料的平均直徑填充不規(guī)則因子

L色譜柱長度第88頁,共144頁，星期六，2024年，5月分子擴散（縱向擴散）第89頁,共144頁，星期六，2024年，5月分子擴散氣體分子擴散對色譜峰寬的貢獻

彎曲因子

Dg溶質(zhì)在氣相中的擴散系數(shù)u流動相流速第90頁,共144頁，星期六，2024年，5月傳質(zhì)阻力物質(zhì)系統(tǒng)由于濃度不均勻而發(fā)生物質(zhì)遷移過程，稱為傳質(zhì)。影響這個過程進行速度的阻力，叫傳質(zhì)阻力。流動相傳質(zhì)阻力固定相傳質(zhì)阻力第91頁,共144頁，星期六，2024年，5月傳質(zhì)阻力

第92頁,共144頁，星期六，2024年，5月流動相傳質(zhì)阻力

k

保留因子第93頁,共144頁，星期六，2024年，5月固定相傳質(zhì)阻力df固定液的液膜厚度

Dl溶質(zhì)在液膜中的擴散系數(shù)第94頁,共144頁，星期六，2024年，5月（二）氣相色譜速率理論方程正態(tài)分布色譜峰的理論塔板高度可以定義為每單位柱長的方差第95頁,共144頁，星期六，2024年，5月氣相色譜速率理論方程第96頁,共144頁，星期六，2024年，5月流速對理論塔板高度的影響第97頁,共144頁，星期六，2024年，5月（三）液相色譜速率理論方程氣相色譜與液相色譜的區(qū)別：溶質(zhì)在液相中的擴散系數(shù)比在氣相中小105倍液體粘度比氣體約大102倍液體的表面張力比氣體約大104倍液體密度比氣體約大103倍液體不可壓縮第98頁,共144頁，星期六，2024年，5月流動區(qū)域中的流動相傳質(zhì)阻力第99頁,共144頁，星期六，2024年，5月流動區(qū)域中的流動相傳質(zhì)阻力Cm:與填充性質(zhì)有關(guān)的因子第100頁,共144頁，星期六，2024年，5月流動相滯留區(qū)的傳質(zhì)阻力第101頁,共144頁，星期六，2024年，5月流動相滯留區(qū)的傳質(zhì)阻力Csm:微孔中流動相及保留因子有關(guān)的常數(shù)第102頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜速率理論方程第103頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜速率理論方程第104頁,共144頁，星期六，2024年，5月不同粒徑填料色譜柱的H-u曲線第105頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜分離速度的變化第106頁,共144頁，星期六，2024年，5月（三）其它因素

色譜峰的不對稱性柱外效應第107頁,共144頁，星期六，2024年，5月吸附等溫線KVR=KVS+VM第108頁,共144頁，星期六，2024年，5月不對稱因子(Asymmetryfactor)As=A/BAs>1拖尾色譜峰；As<1前伸色譜峰第109頁,共144頁，星期六，2024年，5月柱外效應除了色譜柱中發(fā)生的譜帶展寬外，柱外區(qū)域也會造成譜帶的展寬，這種現(xiàn)象稱作柱外效應。主要原因：柱外體積進樣器體積檢測器體積一些連接管道體積第110頁,共144頁，星期六，2024年，5月柱外效應第111頁,共144頁，星期六，2024年，5月柱外效應VR

增大時，柱外效應的重要性減低n較大時，柱外效應有較大的影響第112頁,共144頁，星期六，2024年，5月柱效和選擇性對分離的影響柱效和選擇性對分離的影響第113頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離效果色譜峰的位置------色譜熱力學色譜峰的寬窄------色譜動力學第114頁,共144頁，星期六，2024年，5月18-4分離度（分辨率）分離度：相鄰兩色譜峰保留值之差與兩峰底寬平均值之比第115頁,共144頁，星期六，2024年，5月不同分離度時色譜峰的分離程度第116頁,共144頁，星期六，2024年，5月影響分離度的因素色譜分離基本方程式I柱效因子項；II分離因子項；III容量因子項第117頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離基本方程式的推導設(shè)兩相近的色譜峰基線寬度相等，則有第118頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離基本方程式的推導第119頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離基本方程式的推導由溶質(zhì)保留方程得分離因子為：

=k2/k1tR=ktM+tM第120頁,共144頁，星期六，2024年，5月色譜分離基本方程式I柱效因子項；II分離因子項；III保留因子項第121頁,共144頁，星期六，2024年，5月I柱效因子項分離度與柱效的關(guān)系Rsn1/2增加柱長可提高分離度（分析時間增加，柱壓降增大）減小色譜柱的H值，可提高分離度（有效途徑）第122頁,共144頁，星期六，2024年，5月II分離因子項分離度與色譜柱選擇性的關(guān)系

=1，Rs=0不能分離越大，分離度越大，分離效果越好Rs確定且已知，可由色譜分離基本方程式計算所需理論塔板數(shù)第123頁,共144頁，星期六，2024年，5月II分離因子項第124頁,共144頁，星期六，2024年，5月III保留因子項第125頁,共144頁，星期六，2024年，5月液相色譜流動相對分離的影響第126頁,共144頁，星期六，2024年，5月基本分離方程的應用例有一根1m長的色譜柱，分離組分1和2，得到下列色譜圖。圖中橫坐標l為記錄紙走紙距離。若欲得到Rs=1.2的分離度，有效塔板數(shù)應為多少？色譜柱應加到多長？第127頁,共144頁，星期六，2024年，5月解先求分離因子：

=t’R2/t’R1=(49-5)/(45-5)=1.1求分離度：Rs=2(tR2-tR1)/(Y1+Y2)=(49-45)/5=0.8求有效塔板數(shù)：n有效=16(t’R/Y)2=16((49-5)/5)2=1239若要使R=1.2,所需有效塔板數(shù)為：n有效=16Rs2(/(-1))2n有效=161.22

（1.1/0.1)2=2788所需柱長為：L=2788/1239=2.25m第128頁,共144頁，星期六，2024年，5月18-5色譜定量分析方法在一定的操作條件下，分析組分i的質(zhì)量（mi）或在流動相中的濃度與檢測器的信號（峰面積Ai或峰