【基因測序技術在新生兒遺傳病篩查中的應用研究5900字（論文）】

基因測序技術在新生兒遺傳病篩查中的應用研究目錄TOC\o"1-2"\h\u2891基因測序技術在新生兒遺傳病篩查中的應用研究 115129前言 186091.二代及三代測序技術的原理和分類 228491.1二代測序的原理和分類 2149861.2三代測序的原理和分類 3243212.二代測序在新生兒遺傳病篩查中的應用 4138862.1NGS在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查中的應用 432172.2NGS在產(chǎn)后單基因病篩查中的應用 5142463.三代測序在新生兒遺傳病中的應用 696413.1三代測序在單基因病中的應用 6249724.總結與展望 724846參考文獻 9摘要：新生兒遺傳病是社會公共衛(wèi)生中一項重要的問題，為防治新生兒遺傳性疾病、提高出生人口素質和群體健康水平，新生兒的產(chǎn)前診斷和產(chǎn)后病因鑒定為重中之重。至今，二代測序憑借其高通量、低成本的特點，在臨床診斷中的廣泛應用成為有力工具，同時三代測序憑借其長讀長優(yōu)勢在臨床鑒別診斷中嶄露頭角，兩者各有其優(yōu)勢特點，相互補充在更有深度的分子層面發(fā)揮作用。本文基于此，針對二代和三代測序技術的原理、優(yōu)缺性，以及兩者在新生兒遺傳病篩查中的應用做一綜述，為今后測序領域的研究提供總結，為臨床應用提供指導和建議。關鍵詞：二代測序；三代測序；新生兒；遺傳病篩查前言隨著社會的發(fā)展要求，基于我國出生率下滑而老齡人口不斷增加的現(xiàn)狀，為了更好的實現(xiàn)人口結構的優(yōu)化，我國從2016年起全面開放二胎政策，從而引來了新一輪的生育高峰，進一步增加了高齡產(chǎn)婦的數(shù)量，據(jù)統(tǒng)計，我國每年出生后存在缺陷疾病的新生兒高達90萬[2]，出生缺陷會對患病的兒童、他們的家庭、衛(wèi)生保健系統(tǒng)和社會產(chǎn)生深遠的影響，因此新生兒遺傳性疾病篩查尤為被重視，它是降低出生缺陷、提高人口素質的重要手段之一，目前臨床中主要通過生化檢查、細胞遺傳學和基因診斷等方法為診斷遺傳病提供依據(jù)[3]?；驕y序技術也稱為DNA測序技術，即獲得目的DNA片段堿基排列順序的技術，是分子生物學領域迅速發(fā)展的一項分析技術，在遺傳學診斷中發(fā)揮重要作用。1977年第一代Singer測序的發(fā)明，讓生命科學的研究進入了基因組學的時代，經(jīng)過四十幾年的發(fā)展，測序技術從一代測序發(fā)展到三代測序，經(jīng)歷了革命性的變革。1975年由Sanger和Coulson開創(chuàng)的“雙脫氧鏈終止法”基因測序技術提供了人類探索遺傳本質的方向，以此為開端讓人類步入基因組時代，但由于一代測序檢測成本高，通量較低，同時也無法滿足日趨增長的對各類生物基因序列信息的迫切需求，在此背景下，分子檢測技術引來了技術革新的二代測序，二代測序技術大幅度提高了測序速度，其準確性在Sanger法的基礎上也有所提升，通量高的同時檢測成本的也有所降低，使得分子遺傳學檢測技術逐步被納入臨床實踐中，然而二代測序技術還達不到滿足臨床的快速診斷需求以及對復雜基因序列檢測的需求，自此，測序技術引來了新的里程碑，以長讀長和快速檢測為優(yōu)勢的三代測序應運而生，實現(xiàn)了真正意義上的實時測序。以二代測序技術和三代測序為代表的DNA測序技術迅速發(fā)展，成為篩查新生兒遺傳性疾病的主要技術手段，實現(xiàn)在分子水平層面對新生兒遺傳性疾病的精準檢測。本文將查閱關于二代、三代測序技術的相關文獻，對二代測序和三代測序技術在新生兒遺傳病篩查的應用做一綜述。1.二代及三代測序技術的原理和分類1.1二代測序的原理和分類二代測序技術又稱為下一代測序技術(NextGenerationSequencing，NGS)，NGS可以對數(shù)百萬個DNA進行并行測序，延續(xù)了Sanger測序的部分技術思路[4]。目前，羅氏（Roche）公司的454測序儀、Illumina公司的Solexa分析儀以及ABI公司的SOLiD測序儀是主要測幾個測序平臺。不同平臺測序技術的核心步驟基本一致，主要包括（1）模板制備，如核酸的提取；（2）文庫制備，包括克隆擴增；（3）測序、數(shù)據(jù)分析比對[5]。2005年，羅氏推出了它的454測序技術，它主要采用了焦磷酸測序技術，即檢測核苷酸結合的副產(chǎn)物焦磷酸鹽，以識別特定堿基是否被納入DNA鏈中[6]。主要步驟是將待測DNA樣品打斷成長度為400-700bp的單個DNA片段后，使得片段連接至銜接子構成DNA文庫，然后通過乳液PCR（EmulsionPCR）進行片段擴增，測序時在特質的PTP平板上將磁珠固定住，啟動后每次向PTP平板中加入一種dNTP，而后對DNA合成反應進行化學檢測，當待測核苷酸摻入合成鏈時，利用光反應檢測焦磷酸鹽的釋放，最后通過計算機處理光信號從而檢測出樣品的核酸序列。Illumina是二代測序技術中運用較為廣泛的一個平臺，主導著整個測序市場，其下的Solexa測序儀主要采用可逆終止化學反應的原理，是基于一種稱為“橋式擴增”的技術[7]。它將片段化的DNA碎片末端連接至兩個固定的接頭，構成單鏈DNA測序文庫，然后進行橋式PCR擴增以形成包含克隆DNA片段的簇。每個可逆終止子核苷酸（ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP）在3'-OH基團處受到保護，并包含可裂解的熒光染料。在合成過程中，在脫氧核糖核苷酸被添加到合成鏈上后，洗脫掉游離的dNTP和DNA聚合酶，并釋放出熒光信號，最后使用CCD相機進行成像捕獲和記錄，每一個循環(huán)按順序測定序列中的一個堿基。1.2三代測序的原理和分類與第二代測序方法相比，第三代測序技術旨在對長DNA和RNA分子進行測序，并且測序也無需進行PCR擴增環(huán)節(jié)，在檢測時間方面有巨大提升。目前在該領域商業(yè)化的技術領先者包括PacBio公司的單分子實時測序（singlemoleculereal-time，SMRT）技術和OxfordNanoporeTechnologies（ONT）公司的納米孔單分子技術[8]。SMRT技術的單分子測序和長讀長主要是通過零模波導孔和熒光標記脫氧核苷酸實現(xiàn)的，納米級的零模波導孔能夠包含一個DNA聚合酶和一條樣本DNA鏈，當在DNA鏈上探測到被熒光標記的脫氧核苷酸時，顯微鏡就實時記錄其熒光強度，根據(jù)不同熒光信號標記從而鑒定DNA鏈上的核苷酸分子類別，從而計算出待測樣品的序列[9]。PacBioSMRT測序技術之下有RSⅡ和Sequel兩種測序平臺，在不同的范疇內(nèi)發(fā)揮效用。2.二代測序在新生兒遺傳病篩查中的應用2.1NGS在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查中的應用2.1.1胎兒染色體非整倍異常在胎兒染色體非整倍異常中最常見的是由配子發(fā)生過程中的不相交引起的21、18和13號染色體的三體性引起的。目前，國內(nèi)主流的三大NIPT平臺為：達安DA8600、貝瑞和康NextSeqCN500以及華大基因的BGlSEQ500。大量數(shù)據(jù)研究證明NIPT對于13、18、21號染色體拷貝數(shù)異常的檢測特異性均大于99.9%；T21在檢測敏感性方面最高可達到99.5%，T18為93.1%，T13為92.7%，敏感性略低[11]。而侯偉、周紅輝[12]等人通過選取2018年1月16日-2020年6月30日在解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心的孕婦，結果分析后顯示NIPT整體的特異度為97.61%，陰性預測值97.20%，診斷符合率95.16%。結果存在一定的不確定性，例如存在一部分NIPT顯示低風險但侵入性產(chǎn)前篩查顯示異常的人群，其中主要包括胎兒微缺失重復、嵌合體、雜合性缺失、單親二倍體的染色體異常。該專家組認為NIPT對染色體非整倍異常的檢測具有高敏感性，不推薦將檢測范圍擴展至微缺失重復以及其它染色體異常。2.1.2胎兒染色體微缺失和微重復染色體微缺失微重復一般會導致胎兒智力和身體上的異常，張春花、賀權澤[13]等專家檢測了NIPT的主流三大平臺DA8600、CN500和BGlSEQ500對23170例孕婦外周血樣本進行胎兒染色體微缺失和微復制的篩查，結果表明三大平臺間的陽性預測值無差異，而篩查陽性率存在差異，BGlSEQ500平臺的陽性篩查率為0.58%，高于0.38%的DA8600和0.26%的CN500。該研究表明，用于唐氏綜合癥篩查的NIPT對于染色體微缺失和重復具有一定的預測價值，同時檢測人員和臨床醫(yī)生也要充分意識到NIPT在微缺失微重復的檢測中可能存在假陰性或假陽性的情況，對于NIPT結果陽性的孕婦，臨床醫(yī)生還需要參考額外產(chǎn)前診斷項目才能進行確診，因此也有研究認為對于染色體微缺失微重復的妊娠結局通過NIPT無法在產(chǎn)前可靠地預測[14]。2.1.3單基因病檢測單基因疾病即是由一對等位基因控制的遺傳疾病，因組成基因的堿基發(fā)生改變，導致基因序列異常或者表達異常。軟骨發(fā)育不全是第一種通過NIPT檢測并被引入臨床實踐的單基因疾病[15]，盡管NIPT已廣泛用于染色體非整倍性疾病的檢測當中，但將其用于診斷單基因疾病的臨床應用相對較少，這是由于當前技術下很難區(qū)分母體血樣中胎兒和母體等位基因，尤其是在多個遺傳基因座上，因此這些技術障礙限制了使用cfDNA篩選胎兒單基因疾病的廣泛實施[16]，隨著基因組測序技術的不斷發(fā)展，可能需要克服諸如精確鑒定胎兒等位基因之類的挑戰(zhàn)。2.2NGS在產(chǎn)后單基因病篩查中的應用2.2.1SNV、InDel的檢測單核苷酸變異和插入缺失（<50bp）構成了人類基因組中的絕大多數(shù)基因變異的情況。WES和WGS可以準確識別單核苷酸變體（SNV）和InDel[17]，當SNV和Indel發(fā)生于基因組外顯子區(qū)域或者明確的靶區(qū)時，可以選擇全外顯子測序或者靶向測序，而當SNV和InDel發(fā)生在全基因組時，全基因組測序更為合適[18]。對于臨床診斷較為明確、致病基因有限或突變機制復雜的單基因病，應用TGS能夠保證足夠的測序深度，不僅能夠反映SNV、InDel，還能一定程度上檢出CNV等復雜致病變異，使臨床檢測具有更高的針對性;對于臨床癥狀不典型、難以確診的遺傳病，WES較TGS有更大的覆蓋范圍，能從全外顯子組的水平對基因功能區(qū)進行評估，有利于快速地診斷。例如段麗芬[19]等人使用全外顯子組測序篩選腓骨肌萎縮綜合征的先證者中的致病基因，并進行生物學分析，根據(jù)人類外顯子數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，東亞人群中并未發(fā)現(xiàn)MFN2基因c.1090C>T突變，但經(jīng)WES技術的檢測以及計算機輔助預測，認為在該位點上存在潛在功能影響，該位點存在有害的致病性。2.2.2CNV的檢測拷貝數(shù)變異其實也是作為結構變異中的一部分，異常的DNA拷貝數(shù)變化是許多人類疾病的重要分子機制。Pfundt等[20]對2603例遺傳性疾病患者的WES數(shù)據(jù)進行分析，最終確定123個致病性CNV，說明WES和WGS確實可以從基因組全局水平去提示基因組大片段CNV，提高致病位點檢出率，但是在CNV中還存在著由許多人類疾病基礎的非等位基因同源重組形成的復雜性CNV，NGS并不是最佳的檢測手段，對于此類CNV聯(lián)合性檢測更具有效用，可以選擇染色體微陣列分析(CMA)或CNV-Seq來確定發(fā)生拷貝數(shù)變異的染色體，進一步的斷點分析可以聯(lián)合WGS或者三代測序的技術進行檢測。DarrelWaggoner[21]等人使用CMA技術評估神經(jīng)發(fā)育障礙和先天缺陷，結果顯示對于患有神經(jīng)發(fā)育障礙和先天缺陷的患者，在進行CMA檢測后存在遺漏的細胞基因組異常，例如平衡重排、部分或整個染色體非整倍性的鑲嵌等，因此針對此類拷貝數(shù)異常遺傳性疾病，在分析技術的選擇上十分重要。3.三代測序在新生兒遺傳病中的應用由于NGS短讀法的技術特性，難以通過NGS檢測結構變異、重復元件、鳥嘌呤-胞嘧啶（GC）含量高的序列[22]?；贜GS的這些缺點，極大地推動了研發(fā)新技術提高準確性和減少遺傳疾病診斷時間的進程，由PacBio和ONT引入的三代測序的功能允許實時長讀實時測序，并且在構建文庫時具有較低的比對和定位錯誤[23]，因此對于特殊致病機制的單基因病，例如SV、動態(tài)突變的檢測，可以采用三代測序以彌補NGS的缺陷。當然三代測序本身也能在一些非整倍體異常的情況下使用，并且達到快速檢測的效果，但就檢測成本而言適用性不是很大[24]。3.1三代測序在單基因病中的應用3.1.1動態(tài)突變的檢測動態(tài)突變是由DNA中重復單位拷貝數(shù)發(fā)生擴增而導致的突變，第一個被發(fā)現(xiàn)由動態(tài)突變引起的單基因遺傳性疾病是脆性X綜合征（fragileXsyndrome，F(xiàn)XS），其發(fā)病機制是由于X染色體上FMR1基因5'端非翻譯區(qū)三核苷酸重復序列（CGG）n動態(tài)變異引起[25]，F(xiàn)MR1基因5'端非翻譯區(qū)存在大量的GC堿基片段的重復，二代測序技術的短讀長特性難以在該區(qū)域發(fā)揮作用，而Loomis[26]等專家采用SMRT技術對FXS患者FMR1基因5'端非翻譯區(qū)進行檢測，完成了對(CGG)n重復片段鑒定，該重復片段長達2kb，由此可見三代測序技術在重復堿基區(qū)檢測序列的優(yōu)勢。3.1.2結構變異（SV）的檢測結構變異在遺傳病中起到重要作用，SV包括刪除，插入，倒位，移動元件易位，易位，串聯(lián)重復和拷貝數(shù)變異等形式。SV可以通過改變基因劑量，破壞基因功能或重新排列調(diào)節(jié)元件或基因來改變基因組背景來發(fā)揮功能作用[27]。SV被認為是最難以從短讀數(shù)據(jù)中可靠檢測出的變異形式，因此單分子和實時測序在SV中顯示出了更好的發(fā)現(xiàn)結構變異事件的能力。Merker等[28]在初次嘗試使用IlluminaHiSeq測序技術對Carney綜合征進行研究，但沒有發(fā)現(xiàn)與該綜合征致病相關的基因突變，隨后改用了PacBio的SMRT測序技術，SMRT技術檢測出了6971個缺失和6821個插入，通過篩選獲得了1個雜合子缺失與Carney綜合征中相關基因PRKAR1A的第1個編碼外顯子重疊的情況，該結果表明此雜合子的缺失與Carney綜合征的致病有關，證實了SMRT技術在較為復雜的結構變異中的適用性。4.總結與展望隨著基因組測序技術和基因組數(shù)據(jù)分析的不斷發(fā)展，新生兒遺傳學篩查的領域正在迅速擴大，對篩查胎兒遺傳性疾病的選擇方案也愈加豐富。目前二代測序方法在分子檢測領域的發(fā)展中已經(jīng)趨于成熟，三代測序技術發(fā)展迅速但仍處于研究開發(fā)的狀態(tài)中，他們存在各自的有優(yōu)缺性。二代測序技術的優(yōu)勢在于它的高通量性，對于檢測低頻變異的片段具有較高的靈敏度，同時在較多樣品量的情況下，具有更快的周轉時間以及較低的成本去完成檢測工作，但二代測序也面臨著較大的限制，其短讀長特性限制了NGS在基因的重復區(qū)域或復雜變異中的檢測效果。三代測序技術更長的序列讀取長度且無需進行PCR擴增是其最主要的優(yōu)勢，同時三代測序的樣品制備時間及測序運行時間較NGS相比來得更短，部分平臺例如ONT公司的MinION測序儀還有較高的便攜性和實時測序能力，但是三代測序的成本昂貴，限制了其大規(guī)模的應用于臨床檢測，測序錯誤率也相對較高，只有通過對同一樣本進行反復測序來糾正測序結果，也會因此而增加耗費。另外生物學信息分析軟件的發(fā)展也尤為重要，三代測序不及二代測序發(fā)展全面，信息分析技術還在研究開發(fā)的狀態(tài)，積累的數(shù)據(jù)也較少。總而言之，新生兒遺傳性疾病的篩查對社會人口結構的優(yōu)化、對公共衛(wèi)生的發(fā)展以及個人的身體素質都具有重要意義，希望通過本文能夠優(yōu)化臨床診斷和遺傳咨詢時技術方法的抉擇。同時，也為后續(xù)的研究者提供研究方向的思考，期望未來更多新生兒遺傳性疾病的篩查從產(chǎn)后診斷向產(chǎn)前篩查發(fā)展，擴大無創(chuàng)產(chǎn)前篩查的檢測范圍，提高無創(chuàng)產(chǎn)前DNA篩查的社會普及程度，2018年我國新生人口是1500萬左右，而全年NIPT的樣本量約為400萬，NIPT檢測只覆蓋我國27%的人口[30]，希望在未來該數(shù)據(jù)能有明顯增長。針對二、三代測序的發(fā)展而言，三代測序技術的檢測范圍目前基本囊括二代測序的適用范圍，甚至解決了二代測序無法準確檢測的復雜序列，因而期望未來二、三代測序技術能夠相輔相成結合并行，以此來降低三代檢測成本的同時，也能利用三代測序提高診斷準確率，逐步向更大規(guī)模的臨床早期篩查進發(fā)，為出生缺陷的防控盡一份力，推動發(fā)展精準醫(yī)學，優(yōu)化人口結構。參考文獻[1]歐陽健為.淺談基因測序的重大意義及應用前景[J].神州，2019(5)：239-239.[2]張偉然，趙正言.新生兒疾病基因篩查研究進展[J].中華兒科雜志，2020，58(12)：1033-1037.[3]馬潞林，宋一萌，葛力源.基因測序技術的發(fā)展與臨床應用概述[J].重慶醫(yī)科大學學報，2018，43(4)：7-9.[4]吳爽，強榮，張瑞雪.高通量測序技術在新生兒疾病篩查中的應用進展[J].中國婦幼健康研究雜