ELISA檢測(cè)技術(shù)課件

ELISA檢測(cè)技術(shù)

ELISA技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay，ELISA)，是利用抗體分子能與抗原分子特異性結(jié)合的特點(diǎn)，將游離的雜蛋白和結(jié)合于固相載體的目的蛋白分離，并利用特殊的標(biāo)記物對(duì)其定性或定量分析的一種檢測(cè)方法。ELISA技術(shù)的三個(gè)基本原理抗原或抗體能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗體能與酶通過(guò)共價(jià)鍵形成酶結(jié)合物，同時(shí)保持各自的免疫活性和酶活性；酶結(jié)合物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，能通過(guò)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)確定免疫反應(yīng)的發(fā)生，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比。ELISA的分類(lèi)、原理和操作競(jìng)爭(zhēng)法 原理：通過(guò)a組和b組顯色的差異，來(lái)確定標(biāo)本中待測(cè)蛋白的量加酶標(biāo)記抗原加底物顯色

優(yōu)點(diǎn)：

1、待測(cè)抗原只需一個(gè)免疫結(jié)合位點(diǎn)，適合小分子抗原如激素和藥物之類(lèi)；

2、操作步驟簡(jiǎn)單快捷，只需一個(gè)保溫洗滌過(guò)程。

缺點(diǎn)：

1、酶標(biāo)記抗體的用量大；

2、定量檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性存在不足。雙抗夾心法雙抗夾心法改良雙抗夾心法

優(yōu)點(diǎn)：

1、待測(cè)抗原需要兩個(gè)或兩個(gè)以上的免疫結(jié)合位點(diǎn)，所以適合大分子抗原的檢測(cè)，一般在分子量5000D以上；

2、由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測(cè)的靈敏度，尤其是改良的雙抗加心法；

3、重復(fù)性提高。

缺點(diǎn)：

1、操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。抑制性測(cè)定間接法測(cè)抗原

此方法操作簡(jiǎn)單、迅捷但重復(fù)性一般較差；通常用于抗體效價(jià)的測(cè)定和某些疾病的早期診斷。ELISA的操作要點(diǎn)樣品的保存試劑的準(zhǔn)備加樣固相載體包被洗滌封閉保溫顯色和比色樣本提取與保存

1）在5天內(nèi)測(cè)定的血清標(biāo)本可放置于4℃，超過(guò)一周測(cè)定的需-80℃冰存。

2）取約0.3-0.4g轉(zhuǎn)基因水稻樣品，加500-1000μlPBS緩沖液，用研缽磨碎，將研磨液轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，10000rpm，4℃離心10min，取上清備用。

最佳取樣時(shí)間為水稻分蘗期，取樣時(shí)不同植株應(yīng)取自同一部位的樣品；該樣品依所攜外源基因不同其存放時(shí)間不同；如BT水稻樣品可存放于-20℃三個(gè)月，-80℃半年以上。在提取樣品的過(guò)程中，裝入樣品研磨液的Bf管應(yīng)置于冰浴中；上清應(yīng)置于4℃，最多只能存放4天

試劑的準(zhǔn)備

ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的；自配的緩沖液應(yīng)用pH計(jì)測(cè)量較正；從冰箱中取出的試驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用；最好現(xiàn)配現(xiàn)用。ELISA的固相載體

最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能。國(guó)際上標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。在實(shí)驗(yàn)前，必須經(jīng)紫外射線照射1~2小時(shí)后，其對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2-8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月。包被的方式

定義：將抗原或抗體固定在固相載體的過(guò)程稱(chēng)為包被，抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)及酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。

加樣

在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。加標(biāo)本一般定量多道加液器，使加液過(guò)程迅速完成。封閉

1）定義：是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。

2）目的：抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3）常用試劑：實(shí)驗(yàn)室用的封閉劑是2%的牛血清白蛋白。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的而在洗滌時(shí)可清除在反應(yīng)過(guò)程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)洗滌時(shí)可清除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)洗滌方式（浸泡式）a.

甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；b.用洗滌液過(guò)洗一遍（將洗滌液注滿(mǎn)板孔后，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿(mǎn)板孔，放置3分鐘，間歇搖動(dòng)，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；d.甩去液體后在吸水紙上拍干；e.重復(fù)操作c和d，洗滌3次。保溫

1）在ELISA中抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育。

2）溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。

3）保溫時(shí)為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。顯色和比色顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無(wú)色的底物生成有色的產(chǎn)物。在定量測(cè)定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測(cè)定的顯色時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制及時(shí)判斷。比色使用酶標(biāo)比色儀在405nm波長(zhǎng)讀數(shù)。若要終止反應(yīng)，以防反應(yīng)過(guò)度，常用的堿性磷酸酶反應(yīng)終止液為1MNaOH,每孔100ul。標(biāo)準(zhǔn)曲線建立樣品10μl+990μlPBSBradford法測(cè)定樣品中可溶性蛋白濃度100μl混合液+1000μlG-250紫外分光光度計(jì)、595nm依標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定測(cè)定值*100＝樣品總蛋白濃度用牛血清白蛋白（BSA）建立。分別配制5、10、15、20、30、50、80、100、140（μg?ml-1）的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（用PBS配制）系列。ELISA測(cè)定數(shù)據(jù)的處理

①根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Bt蛋白的量和