如何善用免疫學(xué)檢測技術(shù)篩選優(yōu)-質(zhì)抗體-問題解答

北京義翹神州·在線講座一一《如何善用免疫學(xué)檢測技術(shù)篩選優(yōu)質(zhì)抗體》答疑環(huán)節(jié)匯總非常感謝大家對北京義翹神州在線講座的大力支持，本次講座已圓滿結(jié)束，我們對直播過程中答疑環(huán)節(jié)大家的問題以及老師的解答進行整理如下。如果有需要補充的，有任何建議或想聽到其他更多相關(guān)主題的講座，歡迎來信和我們交流，我們會根據(jù)您的寶貴意見不斷完善，以后給大家?guī)砀喔实脑诰€講座！問題1：怎么確定克隆號呢？流抗與市面上抗體克隆號差別呢？答：每一個平臺在自己開發(fā)抗體的時候都會根據(jù)自己的規(guī)則去命名—些克隆號，這個克隆號與市面上已經(jīng)有的經(jīng)典克隆號不同。想要對比這兩者的差異，常用的手段就是做對比實驗，比較抗體在同樣的陽性細胞和陰性細胞它染色信號，競爭程度等—致程度。問題2:如何確定什么項目適合用什么免疫原？答：主要根據(jù)終端需求，比如說像篩選免疫組化，篩選WB這樣的抗體的時候，因為它的樣本都經(jīng)過不同程度的變性處理，所以我們—般都會優(yōu)先選擇線性表位，就是會嘗試重組蛋白、片段蛋白和多膚。如果開發(fā)的是中和抗體，流式抗體，IP抗體的這種空間構(gòu)象抗體的時候，我們肯定就是會選擇這種首先是有空間結(jié)構(gòu)的重組蛋白，如果在開發(fā)過程中遇到—些間題我們還會再去嘗試DNA免疫、細胞免疫，篩到的可能性會更高—些。通常我們首選真核表達的重組蛋白作為免疫原，成功率也是最高的。問題3:介入篩選是什么？答：在傳統(tǒng)抗體開發(fā)流程中，通常都根據(jù)ELISA檢測信號值作為放行標(biāo)準(zhǔn)，抗體開發(fā)完統(tǒng)—驗證。在抗體篩選的前期階段，ELISA之外我們也可以利用其他比如IHC，流式等手段幫助提升篩選成功率，這種借助終端檢測樣本和方法的手段，提前介抗體篩選的做法，是我們本次課程中所說的介入篩選。問題4：細胞表面抗原結(jié)合的抗體，—般怎么篩選？答：您指的是就是開發(fā)—個表面表達的這種分子，抗體怎么篩選對吧。這樣的話，首先就是在免疫原選好了之后，然后去選擇相對應(yīng)的表達這個分子的細胞系，因為表面抗原的話，—般不會涉及到透膜這種特殊的操作，就是先拿這個細胞系去篩選就可以了。問題5:流式抗體開發(fā)是否會測試每個抗體的使用量？這個是否有標(biāo)準(zhǔn)？答：抗體開發(fā)過程中，因為中間樣本的量很小，抗體濃度通常也不會太高，所以我們都是原液加的。標(biāo)準(zhǔn)的話基本上就是以最終的實驗結(jié)果作為參考，就是把整個實驗體系的對照設(shè)置好，有條件的話通常會加—個陰性對照。問題6:如何用流式細胞儀篩選單克隆抗體／如何使用流式開發(fā)—株陽性細胞株？答：如果想要分離分泌抗體的細胞，用到是分選型流式細胞儀。普通分析型流式，是在雜交瘤有限稀釋后，用陽性細胞系進行鑒定，輔助篩選。問題7:請問流式抗體用滴定方式篩選是否合理？每次測出來結(jié)果都差很多怎么辦？答：弱表達或不分群的抗原，是不適合做滴定的。同時在在使用滴定方法時，要用正式實驗中的細胞，實驗條件也要—致。滴定范圍盡量大—些，梯度盡量多一些。問題8:除了有限稀釋法篩選單克隆抗體，有的資料上寫用流式細胞儀也可以篩選出陽性單克隆細胞株。答：是的，目前單B細胞技術(shù)開發(fā)抗體中，其中—種方法就是借助流式分選，分離出分泌特異抗體的B細胞，再用單細胞測序技術(shù)獲取抗體的序列，用工程細胞株重組表達出來。問題9:不溶性抗原怎么篩選抗體，—般免疫小鼠容易死？答：關(guān)于不溶抗原，我們有做過包涵體和沉淀蛋白，和弗氏佐劑乳化后常規(guī)免疫即可；如果出現(xiàn)小鼠死亡，—般和給藥方式和緩沖液成分有關(guān)。比如沉淀不能靜脈給藥，包涵體緩沖液有鹽酸狐等刺激性成份比較大，再有就是蛋白本身對小鼠的剌激。總體來講，不溶蛋白不會造成小鼠死亡。但需要注意：不溶蛋白的結(jié)構(gòu)—般是不正確的，用千免疫動物存在抗體表位不正確的風(fēng)險。問題10:篩選出的陽性單克隆，在傳代的過程中，抗體表達量逐漸下降甚至丟失，是什么原因怎么避免？答：在傳代過程中，抗體表達量降低有兩種可能：1)多克隆傳代過程中，非特異雜交瘤細胞的增長比例增加，“雜草覆蓋了麥苗”，收料后，總產(chǎn)量降低；2)雜交瘤本身的不穩(wěn)定性，因為兩種基因的雜合，容易出現(xiàn)某種基因在多次培養(yǎng)中丟失的情況。這種建議復(fù)蘇早期的細胞，盡早提基因生產(chǎn)?；蛘撸瑥?fù)蘇早期細胞，大量凍存高代次細胞，減少細胞的培養(yǎng)時間，但這種方法沒法可持續(xù)發(fā)展，也有繼續(xù)丟失風(fēng)險，建議優(yōu)先提基因。針對表達量降低的第—種情況，建議再次有限稀釋，既能保證是單克隆，也能通過稀釋、培養(yǎng)，篩選到較穩(wěn)定的陽性雜交瘤細胞。問題11:老師您好，如果使用雜交瘤技術(shù)ELISA間接法篩選抗體，同—只小鼠，有沒有可能篩選到抗體序列完全—樣的兩株抗體？答：這個幾乎是不太可能的，相比于B細胞的數(shù)量，分泌同樣抗體的細胞數(shù)量非常少，加上雜交瘤篩選步驟多，最后拿到同樣序列的概率非常低。問題12:如何提高篩選效率？答：這個間題涉及的范圍比較廣，總體來看，影響篩選效率的有免疫原質(zhì)量，免疫效果評價，雜交瘤融合平臺的能力，ELISA方法的質(zhì)量，以及其他輔助手段的應(yīng)用等。結(jié)合所需抗體的最終用途，去設(shè)計合適的免疫原這是很關(guān)鍵的—步。免疫平臺和融合平臺的能力要在不斷實踐中提升。抗體篩選是個復(fù)雜過程，是個融合了科學(xué)設(shè)計與運氣的過程。問題13:如何提高ELISA抗體篩選的效率？答：通過包被高低濃度抗原進行篩選，既能防止漏篩，又能節(jié)省工作量。另外就是對ELISA方法本身的優(yōu)化，縮短篩選時間。問題14:能否詳細介紹—下如何使用ELISA方法檢測親和力？答：蛋白做不同濃度進行包板，加入過量酶聯(lián)抗體，收集ELISA信號值，得到—個有明顯上下平臺期的曲線，斜率—般在0.8-1.2(B值）之間，ECSO(C值）即為抗體相對于抗原的親和力值。問題15:免疫組化多染是什么個過程，抗體怎么選擇呢？是跟免疫熒光—樣的嗎？能否普及—下這個實驗？答：免疫組化多染是由抗體驗證，抗體熒光素匹配，抗體組合，染色優(yōu)化等步驟組成的?？贵w驗證階段首先是要做—個免疫組化單染，去評價我們手里這些抗體的可用性，因此能做免疫組化的抗體大概率是能用的。不過也有個例，多染因為涉及反復(fù)加熱，通常會用石蠟切片比較多，跟免疫熒光還是有些差異。問題16:單B細胞技術(shù)生產(chǎn)出來的抗體是不是就不會存在批次間的差異性？答：單克隆批次間的差異更多是由工程細胞生產(chǎn)工藝決定的，比如細胞狀態(tài)，培養(yǎng)條件，收料時間等等。單B細胞技術(shù)解決的是篩選效率的問題，在批間差異這個問題上并沒有優(yōu)勢。問題17:免疫效價和融合效價分別指什么呢？答：免疫效價，通常是指在動物免疫結(jié)束后檢測小鼠的免疫反應(yīng)，通常都是經(jīng)過ELISA效價的評價方法，免疫后血清與免疫前血清同步稀釋，檢測反應(yīng)值，選取免疫后血清是陰性血清2.1倍時，對應(yīng)的那個稀釋度作為小鼠的免疫效價。有限稀釋的步驟，為了保證每個孔里的細胞能存活下來，同時又能有效分離不同的B細胞，需要根據(jù)細胞數(shù)做不同程度的稀釋，這個既能保證單克隆篩選又能保證活率的稀釋度就是融合效價。因為融合平臺能力不同，會拿到存活下來的雜交瘤B細胞數(shù)目也不同，融合效價越高，代表平臺能拿到存活雜交瘤B細胞數(shù)目越多。問題18:您說的od值和親和力的那個公式中，感覺od主要還是跟包被抗原包被量相關(guān)，我個人—直理解的雜交瘤的抗體分泌量應(yīng)該也是—個主要影響因素，不知道自己理解的對不對？答：根據(jù)我們的經(jīng)驗來看的話，絕大多數(shù)抗體分泌量其實都可以達到10μg/mL左右，所以這個分泌量對于ELISA檢測來說其實已經(jīng)是足夠的。問題19:您好！義翹可以提供商品化的人源細胞蠟塊嗎？答：在這方面我們目前主要是以服務(wù)的形式展開的，因為大家的需求不同，需要的這個細胞品系都不太—樣，所以我們都是有目的的去針對大家的需求去開發(fā)這樣的產(chǎn)品。如果您有需要的話可以直接聯(lián)系我們：400-8909989,cro-service@sinobiologicaI.com。北京義翹神州科技股份有限公司(SinoBiologicalInc.)重點從事重組蛋白、抗體、基因、ELISA試劑盒、培養(yǎng)基等產(chǎn)品，以及重組蛋白、抗體的開發(fā)和生物分析檢測等服務(wù)。同時，義翹神州也致力千提供