《青刺果油皮膚功效評(píng)價(jià)規(guī)范》征求意見(jiàn)稿

1T/ACCEMXXXX—XXXX青刺果油皮膚功效評(píng)價(jià)規(guī)范本文件規(guī)定了青刺果油皮膚功效評(píng)價(jià)基本原則、人體功效試驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)報(bào)告。本文件適用于對(duì)青刺果油皮膚功效進(jìn)行評(píng)價(jià)和認(rèn)定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1經(jīng)表皮失水率（TEWL）transepidermalwaterlossrate單位時(shí)間單位面積內(nèi)皮膚水分流失量，單位為克每平方米時(shí)[g/(m2·h)]。4基本原則4.1被測(cè)青刺果油應(yīng)為理化和衛(wèi)生檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品，人體試驗(yàn)之前應(yīng)先按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015年版）》完成必要的毒理學(xué)檢驗(yàn)并出具書(shū)面證明，毒理學(xué)試驗(yàn)不合格的樣品不應(yīng)進(jìn)行人體檢驗(yàn)。4.2青刺果油皮膚功效評(píng)價(jià)試驗(yàn)應(yīng)符合國(guó)際赫爾辛基宣言的基本原則，要求受試者簽署知情同意書(shū)并采取必要的醫(yī)學(xué)防護(hù)措施，最大程度地保護(hù)受試者的利益。4.3試驗(yàn)應(yīng)采用盲法試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則。5人體功效試驗(yàn)5.1試驗(yàn)環(huán)境5.1.1試驗(yàn)環(huán)境溫度應(yīng)保持（21±2)℃,相對(duì)濕度應(yīng)保持（50±10)并進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。5.1.2測(cè)試過(guò)程中，任何一個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)的測(cè)試條件應(yīng)保持一致，如測(cè)試者、場(chǎng)所、環(huán)境、儀器、測(cè)試體位等。所有受試者應(yīng)在測(cè)試環(huán)境條件下適應(yīng)至少30min后方可進(jìn)行評(píng)估和測(cè)試5.2受試者5.2.1受試者納入標(biāo)準(zhǔn)受試者應(yīng)符合以下條件：a)年齡在18歲～60歲之間；b)無(wú)過(guò)敏性疾病，無(wú)化妝品及其他外用制劑過(guò)敏史；c)能夠理解試驗(yàn)過(guò)程，自愿參加試驗(yàn)并簽署書(shū)面知情同意書(shū)，并遵守測(cè)試流程者。2T/ACCEMXXXX—XXXX5.2.2受試者排除標(biāo)準(zhǔn)具備以下條件之一者不應(yīng)作為受試者參加測(cè)試：a)計(jì)劃懷孕或妊娠或哺乳期以及產(chǎn)后六個(gè)月內(nèi)的婦女；b)有嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病，免疫缺陷或自身免疫性疾病者；c)近一周使用抗組胺藥或近一個(gè)月使用過(guò)免疫抑制劑者；d)皮膚待試區(qū)域存在瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣或其他瑕疵而影響試驗(yàn)結(jié)果者；e)近三個(gè)月待試區(qū)域參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)者；f)正在接受治療的呼吸道疾病患者；g)正在接受皮膚治療的人群；h)胰島素依賴(lài)性糖尿病患者；i)其他相應(yīng)的排除標(biāo)準(zhǔn)。5.2.3受試者人數(shù)受試者人數(shù)有效例數(shù)應(yīng)不低于30例。5.3受試物5.3.1試驗(yàn)產(chǎn)品5.3.2對(duì)照產(chǎn)品5.3.2.1陰性對(duì)照：膠帶撕拉+不含青刺果油的葵花籽油。5.3.2.2空白對(duì)照：膠帶撕拉。5.4儀器測(cè)試儀器主要包括：a)分析天平：精度0.1mg；b)經(jīng)表皮失水率測(cè)試儀：TewameterTMHEX或相當(dāng)者；c)皮膚角質(zhì)層水分測(cè)試儀：CorneometerCM825或相當(dāng)者。5.5試劑和材料5.5.1除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級(jí)水。5.5.2試劑與材料主要包括：a)無(wú)屑吸水干紙巾；b)3M低敏膠帶；c)乳膠指套。5.6試驗(yàn)步驟5.6.1試驗(yàn)準(zhǔn)備5.6.1.1通過(guò)初篩的受試者到達(dá)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室后，由檢測(cè)人員篩選前臂符合要求（無(wú)瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣等）的受試者。5.6.1.2受試者測(cè)試前30min內(nèi)不能喝水飲食，按要求使用無(wú)屑吸水干紙巾對(duì)待測(cè)區(qū)域進(jìn)行擦拭，在溫度（20～22）℃,濕度（40～60）%RH的環(huán)境靜坐平衡30min。3T/ACCEMXXXX—XXXX5.6.1.3由檢測(cè)人員在受試者雙手前臂內(nèi)側(cè)處標(biāo)記3個(gè)3cm×3cm的測(cè)試區(qū)域。產(chǎn)品涂抹區(qū)、空白對(duì)照區(qū)和陰性對(duì)照區(qū)應(yīng)隨機(jī)分布于左右手臂標(biāo)記區(qū)域，確保測(cè)試產(chǎn)品、空白對(duì)照和陰性對(duì)照區(qū)域位置在統(tǒng)計(jì)學(xué)上達(dá)到平衡。測(cè)試區(qū)域如圖1所示。圖1測(cè)試區(qū)域示意圖5.6.2測(cè)定5.6.2.1基礎(chǔ)值TO由檢測(cè)人員進(jìn)行TEWL值、角質(zhì)層水分含量檢測(cè)。5.6.2.2損傷后即刻T1使用3M低敏膠帶在測(cè)試區(qū)域粘貼皮膚，直到TEWL值＞15g/(m2·h)，記錄TEWL數(shù)值，并檢測(cè)角質(zhì)層水分含量。5.6.2.3使用樣品后T2、T3、T4根據(jù)隨機(jī)表，由檢測(cè)人員使用乳膠指套在受試者測(cè)試區(qū)域均勻涂抹樣品（2.0±0.1)mg/cm2。由檢測(cè)人員分別于使用樣品后1h(T2)、2h(T3)、3h(T4)，進(jìn)行TEWL值、角質(zhì)層水分含量檢測(cè)。儀器測(cè)試如表1所示。表1儀器測(cè)試5.6.3完成試驗(yàn)結(jié)束測(cè)試，有序安排受試者離開(kāi)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室。5.7試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析5.7.1應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)表示為：均值±標(biāo)準(zhǔn)差。若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，否則采用秩和檢驗(yàn)。上述統(tǒng)計(jì)分析均為雙尾檢驗(yàn)，顯著性水平為α=0.05。5.7.2變化率=(使用樣品后數(shù)值-損傷后即刻數(shù)值)/損傷后即刻數(shù)值。5.8試驗(yàn)結(jié)果判定試驗(yàn)產(chǎn)品區(qū)任一測(cè)試時(shí)間點(diǎn)與損傷后即刻的差值，經(jīng)表皮水分流失率（主要參數(shù)）顯著優(yōu)于對(duì)照區(qū)（陰性對(duì)照或空白對(duì)照）(p＜0.05）時(shí)，則認(rèn)定試驗(yàn)產(chǎn)品在該試驗(yàn)周期內(nèi)有修護(hù)功效。4T/ACCEMXXXX—XXXX6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)6.1原理采用細(xì)胞劃痕插件制備HaCaT細(xì)胞劃痕模型，給藥后進(jìn)行顯微鏡拍照，通過(guò)ImageJ計(jì)算愈合率，愈合率值越大說(shuō)明受試物對(duì)于HaCaT細(xì)胞的屏障修復(fù)功效越好。6.2試劑試驗(yàn)使用試劑包括：a)DMEM培養(yǎng)基；b)胎牛血清FBS；c)CCK-8檢測(cè)試劑盒；d)胰酶（trypsin-EDTA0.25%);e)細(xì)胞劃痕插件；f)無(wú)血清細(xì)胞凍存液；g)12孔細(xì)胞培養(yǎng)板；h)10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。6.3實(shí)驗(yàn)步驟6.3.1將細(xì)胞劃痕插件放置在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HaCaT細(xì)胞。6.3.2在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)細(xì)胞24h，移除插件后，PBS輕柔沖洗細(xì)胞，加入5％和10%青刺果油提取物，孵育0h、16h、24h后，顯微鏡下拍照記錄。如圖2所示，其中：A為PBS空白組，0h；B為5％青刺果油提取物，0h；C為10％青刺果油提取物，0h；D為PBS空白組，16h；E為5％青刺果油提取物，16h；F為10％青刺果油提取物，16h；G為PBS空白組，24h；H為5％青刺果油提取物，24h；I為10％青刺果油提取物，24h。圖2顯微鏡圖6.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析對(duì)比PBS空白組、5％青刺果油提取物和10％青刺果油提取物分別在16h和24h對(duì)HaCaT細(xì)胞的愈合率。如圖3所示。5T/ACCEMXXXX—XXXX圖3愈合率對(duì)比6.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定與PBS空白組相比，5％的青刺果油及10％的青刺果油均能夠促進(jìn)HaCaT體外劃痕的愈合，其中5％的青刺果油在24h后效果最佳，愈合率為86.4因此證明青刺果油可以加速HaCaT細(xì)胞的遷移，促進(jìn)傷口愈